Двухмерная визуализация и количественная оценка питательных веществ и загрязняющих веществ в почве

Био- и химический круговорот элементов в почве играет решающую роль в экологических системах. С помощью этого протокола распределение доступных растительных фракций элементов может быть визуализировано в 2D с помощью масс-спектрометрии DGT. Этот метод уникален своей способностью визуализировать и количественно определять ультраследовые уровни множественных неорганических растворенных веществ на границе раздела растворенных веществ, что значительно превышает пространственное разрешение альтернативных методов.

В дополнение к исследованию потоков труда и растворенных веществ в почве и отложениях, этот метод может быть применен для изучения того, как корни растений поглощают питательные и загрязняющие элементы. Для изготовления геля DGT сначала нанесите тонкий слой смешанной суспензии анионов и гелей, связывающих катионы, на стеклянную пластину и поместите пластину в печь, чтобы инициировать образование геля путем испарения растворителя. После повторения нанесения и трехкратного выпаривания увлажните полученную стеклянную пластину с тройным покрытием на водяной бане, чтобы получить тонкий на разрыв гель толщиной 0,1 миллиметра, устойчивый к разрыву, смешанный гель, связывающий анион и катионы.

Чтобы собрать ризотрон, с помощью двух зажимов прикрепите одно маленькое акриловое лезвие в нижней части подъема ризотрона с давлением зажимов, направленных на раму ризотрона, чтобы пластина не загибалась внутрь. Слегка наклоните ризотрон в сторону небольшой пластиковой пластины и заполните ризотрон предварительно увлажненным грунтом до высоты примерно четырех сантиметров. Слегка взболтайте корневище, чтобы равномерно распределить почву, и используйте уплотнительный инструмент, чтобы аккуратно уплотнить почву на несколько миллиметров.

Повторяйте заполнение и уплотнение до тех пор, пока корневище не заполнится почвой, оставляя зазор в три сантиметра вверху. Используйте ленту, чтобы аккуратно закрепить кусок фольги из ПТФЭ размером 13 на 22 сантиметра к раме ризотрона по одному углу за раз, применяя натяжение, чтобы обеспечить плоскую поверхность фольги. Когда фольга из ПТФЭ станет плоской и прилегает к поверхности почвы, прикрепите второй кусок фольги к нижнему концу ризотрона, перекрывая верхний кусок фольги из ПТФЭ на один сантиметр таким же образом.

Когда вторая деталь будет закреплена, наложите защитный чехол из пластиковой фольги. Поместите переднюю пластину на заполненный почвой и покрытый фольгой ризотрон и поместите по одной направляющей вокруг каждой стороны ризотрона. Затем затяните винты вручную, чтобы зафиксировать направляющие в передней панели к ризотрону так, чтобы винты располагались по направлению к закрытой стороне ризотрона.

Чтобы полить почву, вставьте наконечники пипеток в отверстия для полива и позвольте воде стекать в почву под действием силы тяжести. Чтобы вырастить растения, высадите в ризотрон до двух саженцев и добавьте пять миллилитров воды непосредственно к рассаде, чтобы поддержать ее рост. Накройте верхнее отверстие ризотрона на первые два дня после посадки прозрачной влагоудерживающей пленкой и заверните ризотрон в алюминиевую фольгу, чтобы предотвратить рост микрофитов.

Затем поместите посаженный ризотрон в комнату для выращивания с условиями окружающей среды, установленными в соответствии с конкретными требованиями растения, и наклоните ризотрон на 25-35 градусов, чтобы обеспечить развитие корней вдоль передней пластины с помощью гравитропизма. Чтобы нанести изготовленный гель DGT, разрежьте поликарбонатную мембрану толщиной 10 микрон с размером пор 0,2 микрона до ширины и длины не менее одного сантиметра с каждой стороны геля и поместите мембрану на гель. Нанесите воду, чтобы удалить пузырьки воздуха из стопки, и с помощью виниловой изоленты закрепите мембрану на пластине по всем четырем краям геля.

После снятия передней панели и защитной пленки совместите видоискатель цифрового однообъективного зеркального фотоаппарата, оснащенного макрообъективом, с центром интересующей области в геле и включающей масштабную линейку в изображение, чтобы получить ортогональную фотографию интересующей области. Затем совместите один край пластины, оснащенной гелевой мембранной стопкой, с краем открытого ризотрона. Аккуратно согните пластину в сторону почвы и с помощью направляющих и винтов прикрепите пластину к ризотрону.

После периода отбора проб в одиночестве перенесите переднюю пластину из ризотрона в колпак ламинарного потока стороной стека гелевой мембраны вверх и осторожно снимите ленту и поликарбонатную мембрану, покрывающую гель. Нанесите воду, чтобы гель свободно плавал на тонкой водной пленке на пластине стороной, контактирующей с почвой, вверх, и перенесите гель на мембрану из полиэфирсульфона с размером пор 0,45 микрона и подложкой для промокательной бумаги. Накрыв гелевый стек защитной пленкой, поместите его в вакуумную гелевую сушилку.

Когда гель полностью высохнет, с помощью двустороннего скотча закрепите сухой гель вместе с другими образцами геля на стеклянной пластине. Для проведения анализа сухих гелей DGT методом лазерной абляции методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой сначала зафиксируйте заготовки и стандарты образца на предметном столике для лазерной абляции и зафиксируйте лазерный столик в ячейке абляции системы лазерной абляции. В программном обеспечении лазерной абляции переместите интересующую область на поверхности геля и проведите одну, длиной примерно в один миллилитр, поперек поверхности гелевого стандарта.

Щелкните правой кнопкой мыши линию в окне шаблонов сканирования, чтобы убедиться, что параметры лазерной абляции были установлены и приняты, и используйте инструмент дублирования сканирования, чтобы продублировать эту линию четыре раза с межстрочным расстоянием, превышающим диаметр пятна. После повторения этой линии для каждой стандартной калибровочной заготовки геля и заготовки метода проведите одну линию вдоль верхнего края прямоугольной области анализируемого образца геля и продублируйте линию для создания параллельных линий для всей области образца, как показано на рисунке, используя межлинейное расстояние от 300 до 400 микрометров. Убедитесь, что каждая начальная и конечная точки каждой линии правильно сфокусированы на поверхности геля, и нажмите кнопку «Анализ партии», чтобы начать последовательность образцов на масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой.

Нажмите на излучение в окне лазерной энергии для подзарядки лазерной головки. Нажмите кнопку Выполнить, чтобы открыть окно запуска эксперимента и выбрать только выбранные шаблоны. Установите задержку смывателя на 20–30 секунд.

Выберите включенный лазер во время сканирования и установите время прогрева лазера на 10 секунд. Затем нажмите кнопку «Выполнить» и «ОК», чтобы начать анализ линейного сканирования и отслеживать интенсивность исходного сигнала в отсчетах в секунду для каждого изотопа на масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой в режиме реального времени. Каждая строка должна начинаться и заканчиваться газовой заготовкой.

После анализа импортируйте файл исходных данных для каждой удаленной строки в таблицу. В таблице исходных данных показаны показания масс-спектрометрии индуктивно связанной плазмы для каждого изотопа в отсчетах в секунду и соответствующие временные точки в секундах. Перечислите все строки рядом друг с другом в разных столбцах.

Рассчитайте среднее значение холостого газа для каждого изотопа из всех значений холостых газов, зарегистрированных до абляции линии, и вычтите среднее значение холостого газа из соответствующих исходных интенсивностей для каждого изотопа для поправки на фоновый сигнал. Чтобы применить внутреннюю нормализацию, разделите интенсивность скорректированного сигнала каждого изотопа на интенсивность скорректированного сигнала внутреннего стандарта углерода 13 для каждой точки данных, чтобы скорректировать изменения количества абляционируемого материала и инструментального дрейфа. Обрезайте данные до начала и после конца каждой абляционной строки, чтобы удалить пустой фоновый сигнал газа, и транспонируйте таблицу данных для получения матрицы сетки, в которой каждая строка соответствует абляционной линии, а каждый столбец соответствует нормализованному значению интенсивности изотопа.

Затем примените функцию калибровки, полученную в результате анализа стандартов геля, и сохраните откалиброванную матрицу данных в виде текстового файла. Чтобы создать изображение, импортируйте откалиброванную матрицу данных образца в программное обеспечение для анализа изображений в виде текстового изображения и примените поправочный коэффициент соотношения сторон и таблицу преобразования для визуализации химических градиентов в растворенном изображении. Отрегулируйте цветовой баланс изображения, чтобы контролировать нижнюю и верхнюю границы диапазона отображения, добавьте калибровочную полосу и сохраните растворенное изображение в виде файла TIF.

Используйте команду Копировать в систему, чтобы скопировать твердотельное изображение и вставить его в настольную издательскую программу. Затем масштабируйте, сопоставляйте, выравнивайте и компонуйте твердотельное изображение с фотографией интересующей области и другими растворенными изображениями. Сопоставление изображений растворенного вещества с фотографическим изображением исследуемой области показывает, что субмиллиметровое распределение потока 2D твердых тел различных элементов сильно варьируется в зависимости от структуры почвы и морфологии корня.

Например, в этом анализе молодого корня гречихи, выращенного в свободной карбонатной почве, удобренной аммиачной селитрой, субмиллиметровое распределение растворенного вещества показало зоны снижения потоков алюминия, фосфора и железа рядом со старыми корневыми срезами из-за поглощения корней и значительное увеличение потоков магния, алюминия, фосфора, марганца и железа на верхушке корня из-за локализованных процессов мобилизации питательных веществ. В этом анализе можно наблюдать отчетливое истощение цинка, кадмия и свинца в непосредственной близости от корня, что иллюстрирует, что корни устойчивой к металлам ивы Salix smithiana действуют как локализованный поглотитель для лабилевых следов металлов в загрязненной почве. В этом анализе распределение лабилевых следов металлов вдоль корней Salix smithiana было локализовано с распределением pH с использованием комбинированного однослойного планарного геля для связывания катионов оптода и DGT.

Эта комбинация методов показала, что увеличение потоков растворенных веществ марганца, железа, кобальта, никеля, меди и свинца было связано со снижением pH примерно на одну единицу, что свидетельствует об индуцированной pH солюбилизации металлов. Крайне важно обеспечить тесный и стабильный контакт между инструментом DGT и твердой поверхностью, чтобы избежать аналитических артефактов. Если вы сомневаетесь, повторите процедуру нанесения геля.

Этот метод может быть объединен с другими методами визуализации твердых тел на основе диффузии, такими как планарные оптоды, для одновременной оценки ряда параметров, участвующих в поглощении элементов растения.