Одноклеточная электропорация по различным органотипическим культурам срезов возбуждающих и специфических для класса тормозных нейронов гиппокампа мыши
6 октября 2020 г.
Здесь представлен протокол для одноклеточной электропорации, который может доставлять гены как в возбуждающие, так и в тормозные нейроны в диапазоне возрастов культуры среза гиппокампа in vitro. Наш подход обеспечивает точную и эффективную экспрессию генов в отдельных клетках, которая может быть использована для изучения клеточных автономных и межклеточных функций.
Трансфекция генов является жизненно важным подходом для исследований в области нейробиологии. Наша технология электропорации позволяет трансфицировать интересующие нас гены интернейронов в органотипическую культуру среза гиппокампа без обнаруживаемых побочных эффектов. Этот протокол имеет гораздо более высокую эффективность трансфекции по сравнению с другими протоколами одиночных клеток, но он все еще относительно недорог и прост в исполнении.
Этот метод будет полезен исследователям, заинтересованным в понимании конкретных молекулярных и физиологических функций нейронов, включая механизмы автономии клеток и транссинаптические белковые взаимодействия. Чтобы подготовить срезы культур для электропорации, перенесите интересующие вас вкладыши для культур в отдельные трехсантиметровые чашки Петри, загруженные 900 микролитрами питательной среды, и поместите культуры в настольный инкубатор с углекислым газом. Затем предварительно инкубируйте вкладыши для свежих культур с одним миллилитром питательной среды для срезов на каждый вкладыш в чашке Петри диаметром 3,5 см в течение не менее 30 минут и стерилизуйте линии электропорационной установки 10%-ным отбеливателем в течение пяти минут.
По окончании перфузии промойте линии ионизированной автоклавной водой в течение не менее 30 минут перед перфузией стерилизованным фильтром ACSF, содержащим 0,001 миллимолярного тетродотоксина. Установите импульс электропоратора на амплитуду минус пять вольт, квадратный импульс, последовательность 500 миллисекунд, частоту 50 герц и ширину импульса 500 микросекунд. Наполните стеклянную пипетку пятью микролитрами раствора, содержащего плазмиды, и осторожно похлопайте по наконечнику несколько раз, чтобы удалить все захваченные пузырьки.
С помощью диссекционного микроскопа убедитесь, что наконечник не поврежден, и надежно прикрепите наконечник пипетки к электроду. Когда наконечник соприкоснется с ACSF, запишите показания сопротивления пипетки электропоратора. Чтобы изолировать культуру среза, разрежьте мембрану вставки культуры острым лезвием и с помощью щипцов под острым углом осторожно перенесите культуру среза в камеру электропорации.
Затем зафиксируйте положение культуры с помощью якоря для срезов. Для электропорации интересующих клеток приложите положительное давление к пипетке ртом и с помощью трехмерных регуляторов переместите наконечник пипетки к поверхности культуры среза. Рассматривая культуру под микроскопом, приближайтесь к клетке-мишени с помощью наконечника, сохраняя приложенное положительное давление до тех пор, пока на поверхности клетки не образуется ямочка.
После визуализации ямочки быстро надавите ртом на умеренное отрицательное давление, чтобы между кончиком пипетки и плазматической мембраной образовалось рыхлое уплотнение. Мембрана будет немного входить в пипетку. Следует наблюдать примерно 2,5-кратное увеличение начального сопротивления пипетки, о чем свидетельствует увеличение тона из динамиков.
Быстро снова надавите на нее, чтобы ямочка восстановилась. Затем немедленно завершите еще как минимум два цикла давления, как только что было продемонстрировано, без паузы. После последнего импульса давления удерживайте отрицательное давление в течение одной секунды.
Когда тон динамиков достигнет стабильной вершины высоты, используйте ножную педаль для быстрого пульсации электропоратора. После электропорации осторожно втяните пипетку примерно на 100 микрон от ячейки, не прикладывая давления, и снова приложите положительное давление, убедившись, что сопротивление аналогично базовому показателю, прежде чем приближаться к следующей ячейке. Когда все интересующие клетки будут подвергнуты электропорации, перенесите культуру среза в одну из подготовленных вставок для свежих культур и поместите вкладыш при температуре 35 градусов Цельсия на срок до трех дней.
В этом репрезентативном эксперименте EGFP трансфицировали в 5-20 пирамидных нейронов в области CA1 гиппокампа в течение семи, 14 и 21 дня в возрасте культивирования среза in vitro. Парвальбумин и везикулярные глутаматные интернейроны 3-го типа также могут быть успешно электропорированы в области CA1 гиппокампа. Интересно, что на трансфекцию существенно не влияет дневной возраст культивирования среза in vitro и она не отличается от эффективности трансфекции, наблюдаемой в пирамидальных нейронах CA1.
Нейроны очень хрупкие. Вы должны быть предельно осторожны и аккуратны при приближении и давлении на ячейки и втягивании наконечника пипетки, чтобы не нанести серьезный ущерб. После электропорации клетки могут быть подвергнуты различным экспериментальным анализам, включая электрофизиологию и визуализацию.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол электропорации единичных клеток, который позволяет осуществлять доставку генов как в возбуждающие, так и в тормозные нейроны в органотипических культурах срезов гиппокампа. Этот метод обеспечивает точный контроль экспрессии генов, что облегчает изучение как клеточно-автономных механизмов, так и межклеточных взаимодействий на различных стадиях развития.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Трансфекция генов
- Электрофизиология
Теоретические основы
- Трансфекция генов имеет решающее значение для нейробиологических исследований.
- Электропорация обеспечивает высокую эффективность трансфекции при минимальных побочных эффектах.
- Этот метод относительно прост и недорог по сравнению с другими методами.
- Понимание молекулярных и физиологических функций нейронов необходимо для нейробиологии.
Цель исследования
- Разработка эффективного метода трансфекции генов в популяциях нейронов.
- Изучение специфических молекулярных функций и механизмов как в возбуждающих, так и в тормозных нейронах.
- Оценка эффективности трансфекции в культурах срезов разного возраста.
Используемые методы
- Электропорация проводилась на органотипических культурах срезов гиппокампа.
- В качестве основных биологических моделей использовались пирамидальные нейроны и интернейроны.
- Эффективность трансфекции оценивали на срезах разного возраста (7, 14 и 21 день in vitro).
- Подробные этапы включают подготовку, методы пипетирования и мониторинг изменений сопротивления.
- Повреждения клеток в процессе процедуры сводились к минимуму за счет осторожного манипулирования.
Основные результаты
- Высокая эффективность трансфекции генов была достигнута в целевых нейронах без значительных различий в зависимости от возраста культур срезов.
- Электропорация не оказала неблагоприятного влияния на жизнеспособность, сохранив целостность клеток после трансфекции.
- Данный метод позволил детально изучить физиологические ответы и потенциальные механизмы взаимодействия между нейронами.
- Также была продемонстрирована успешная трансфекция интернейронов pars и везикулярного глутамата 3-го типа.
Выводы
- В данном исследовании представлен надежный протокол трансфекции генов в культурах нейронов, расширяющий возможности исследований в области нейробиологии.
- Данный метод закладывает основу для дальнейшего изучения нейрональных механизмов и межклеточных функций.
- Понимание этих процессов имеет решающее значение для изучения нейрональной пластичности и поиска потенциальных терапевтических применений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Электропорация отдельных клеток в органотипических культурах срезов гиппокампа обеспечивает точную доставку генов в возбуждающие и тормозные нейроны, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в нейробиологических исследованиях. Метод характеризуется высокой эффективностью трансфекции (~80%) на различных стадиях развития, что позволяет проводить стабильный фенотипический скрининг и разрабатывать анализы для изучения сигнальных путей. Данный подход снижает биологическую неопределенность при первоначальном тестировании гипотез о мишенях, обеспечивая воспроизводимые количественные исследования экспрессии генов в нейронных системах, релевантных для изучаемых заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы в возбуждающих и специфических по классу тормозных нейронах гиппокампа.
- Научная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем установления связи между экспрессией генов и физиологическими показателями в интактных микросхемах.
- Практическая ценность: Обеспечивает высокую эффективность трансфекции без выявляемых побочных эффектов, что снижает вариабельность экспериментов.
- Практическая ценность: Применимо для культур срезов разного возраста (7–21 день in vitro), что позволяет проводить исследования временной динамики взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных нейронных систем для последующего электрофизиологического анализа и методов визуализации.
- Научная ценность: Получение количественных данных с разрешением до одной клетки о функциях генов и белковых взаимодействиях.
- Практическая ценность: Использование стандартного электрофизиологического оборудования, что обеспечивает масштабируемую интеграцию в существующие рабочие процессы.
- Практическая ценность: Сохранение эффективности трансфекции в течение длительных периодов культивирования, что позволяет проводить лонгитюдные скрининговые исследования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает создание релевантных для заболевания нейронных цепей гиппокампа для изучения целевых механизмов в патофизиологическом контексте.
- Научная ценность: позволяет оценивать транссинаптические белковые взаимодействия и клеточно-автономные механизмы.
- Практическая ценность: способствует непрерывности процесса от открытия до доклинической валидации за счет поддержания жизнеспособности нейронов после трансфекции.
- Практическая ценность: поддерживает принятие взвешенных решений о дальнейшем развитии проекта благодаря надежной и воспроизводимой доставке генов в первичные культуры нейронов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез относительно мишени до идентификации соединений-лидеров, что позволяет снизить механистические риски перед началом скрининга соединений.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в популяциях нейронов гиппокампа.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу системы с воспроизводимой трансфекцией и количественными показателями для оценки соединений.
- Аналитика: позволяет проводить мониторинг на основе резистентности и электрофизиологический анализ для установления корреляции между экспрессией генов и функциональными фенотипами.
- Трансляционные исследования: связывают изучение функций генов с доклиническими исследованиями посредством стабильной трансфекции в органотипических срезах.
- Корпоративное повторное использование: задействует существующую инфраструктуру для электрофизиологических исследований, позиционируя данный метод как универсальную платформу для валидации нейрональных мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишеней за счет высокоэффективной и низкотоксичной доставки генов в первичные нейроны.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря согласованным параметрам импульсов и протоколу циклов давления.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейших исследований (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности при взаимодействии с нейрональными мишенями.
- Влияние на портфель проектов: Приоритизация с учетом рисков посредством надежной оценки функции генов в различных классах нейронов и на разных стадиях развития.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области электрофизиологии и манипуляций с микропипетками для нацеливания на отдельные клетки.
- Необходимы стеклянные электроды, электропоратор и стерильный раствор ACSF с тетродотоксином для поддержания жизнеспособности нейронов.
- Требуется стандартизация последовательностей импульсов давления и мониторинг сопротивления для всех пользователей.
- При адаптации метода следует учитывать корректировку концентрации плазмиды и длительности импульса для различных типов нейронов или размеров генов.
- Практическое ограничение: хрупкость нейронов требует тщательного соблюдения техники, чтобы избежать разрыва мембраны во время циклов подачи давления.
