Изоляция murine сперматогенных клеток с помощью фиолетово-возбужденных клеток проницаемых ДНК Связывание красителя
14 января 2021 г.
Здесь мы представляем простой и эффективный метод изоляции живых мейотических и постмейотических зародышевых клеток от взрослых мышей. Используя низкоцитотоксичность, фиолетовый возбужденный краситель связывания ДНК и флуоресценцию активированной сортировки клеток, можно изолировать высокообогащеные популяции сперматозоидов для многих нисходящих приложений.
Этот новый эффективный метод изоляции субпопуляций сперматозоидов и сперматозоидов от взрослых мышей может быть использован для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе мейоза и сперматогенеза. Этот метод использует низкой цитотоксичности ДНК связывания красителя с широким спектром возбуждения, которые могут быть применены к наиболее используемых в настоящее время заказов FACS. Этот метод очень прост.
Наиболее сложным аспектом является цитометрия потока gating, но подробная стратегия gating должны помочь с адаптацией протокола к другим сортаторам клеток. Демонстрацией процедуры будет yu-Han Yeh, научный сотрудник лаборатории Сатоши Наметкавы. После сбора обоих яище от восьминедельного самца мыши, поместите ткани в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую два миллилитров ледяного PBS и удалите туника альбугинеа.
Аккуратно отделите яички типсами, чтобы слегка разогнать семенные трубочки. И перенесите трубоубий в каплю свежего ледяного PBS в 100-миллиметровую чашку Петри. Используйте типсы, чтобы аккуратно распутать трубоушки и мыть трубоушки в трех дополнительных капель PBS, как только что продемонстрировали.
После последней стирки поместите распутанные семенные трубочки в 15-миллилитровую трубку, содержащую два миллилитров буфера диссоциации для 20-минутной инкубации при 37 градусах цельсия. В конце инкубации используйте трубу из 1000 микролитров, чтобы аккуратно пипетку труб 20 раз, прежде чем вернуть трубку в инкубатор еще на шесть минут. В конце инкубации, пипетки ткани еще 20 раз, прежде чем вернуть трубку в инкубатор.
Через три минуты, осторожно пипетки трубы 10 раз или до тех пор, пока видимые части ткани остаются, прежде чем остановить диссоциацию с 10 миллилитров буфера FACS. Затем центрифуга к подвеске ткани два раза с помощью дополнительных 10 миллилитров для свежего буфера FACS для второй стирки, чтобы удалить сперматозоиды и как можно больше мусора, как это возможно. Чтобы испачкать клетки для цитометрического анализа потока, повторно приостанавливайте гранулы в три миллилитров буфера FACS.
И фильтровать подвеску клетки через 70 микрон нейлоновых клеток ситечко, в 50 миллилитров трубки. После подсчета, передача 10% клеток в новую трубку на льду, как незапачканный отрицательный контроль. И тщательно смешать шесть микролитров пятна DCV в оставшейся клеточной подвески.
После 30-минутной инкубации при 37 градусах По Цельсию в темноте с нежной тряской каждые 10 минут добавляйте в клетки пять микролитров DNase I. И фильтровать клетки через 35 микрон нейлоновой сетки ситечко в пять миллилитров FACS трубки на льду. Для цитометрического анализа потока клеток, создать новый эксперимент в программном обеспечении анализа потока, и в меню инструментов листа, нажмите новую плотность, чтобы создать передовую область рассеяния по сравнению с backscatter области плотности участка в линейном масштабе.
Нажмите на новую гистограмму, чтобы создать сюжет dcV синей гистограммы в логаритмическом масштабе. И нажмите кнопку начать и записать, чтобы начать обработку необлитаемого образца. В то время как образец работает, нажмите детектор и настройки порога, чтобы настроить как вперед, так и боковой рассеяния PMT напряжения для места необитых клеток в масштабе вперед и назад рассеяния участка.
Отрегулируйте напряжение PMT для канала jappy для того чтобы обнаружить местонахождение населенности DCV отрицательной в первой декаде участка logarithmic голубой гистограммы DCV. Затем нажмите стоп, чтобы выгрузить незапачканный образец. После краткого вихревого и загрузки окрашенных образца, нажмите следующую трубку, чтобы создать новый лист для образца.
Установите цитометр, чтобы приобрести по крайней мере один раз от 10 до шести событий, и нажмите кнопку начала и записи. Далее щелкните новую плотность, чтобы создать вперед высоту рассеяния по сравнению с вперед шириной рассеяния. И DCV синий против DCV красной плотности участков в линейном масштабе.
На передовую область рассеяния по сравнению с backscatter области плотности участка, использовать полигон инструмент, чтобы нарисовать ворота называется клетки, чтобы включить большую часть клеток и исключить мелкий мусор. Примените эти ворота к высоте вперед рассеяния по сравнению с вперед участок ширины рассеяния и использовать прямоугольник инструмент, чтобы нарисовать ворота одной ячейки, чтобы исключить не одной ячейки. Нанесите ворота одной ячейки на синий цвет DCV и участок красной плотности DCV и отрегулируйте шкалу для захвата расширенного профиля.
Используйте полигон инструмент, чтобы нарисовать ворота DCV, чтобы исключить незапачканные клетки и боковой популяции, и применить ворота к dcV синий участок гистограммы в линейном масштабе. Три основных пика относятся к различным содержанию ДНК 1C, 2C и 4C. Создайте второй синий DCV против dcV красный участок плотности в линейном масштабе.
И задние ворота DCV ворота на участок, чтобы найти 1C и 4C населения. Создайте другой dcV синий против DCV красный участок плотности в линейном масштабе. И используйте эллипс инструмент, чтобы нарисовать ворота на 1C населения.
Используйте полигон инструмент для ворот 4C населения с непрерывной кривой. И создать еще один DCV синий против DCV красной плотности участка в линейном масштабе. Используйте полигон инструмент для создания 4C один ворота.
В новом вперед бок о бок рассеяния участка, использовать эллипсовый инструмент для создания pachytene, диплотен и лептотен, zygotene сперматоцитов ворот. Когда все ворота были нарисованы, создать новый DCV синий против DCV красный цвет точка участок на линейной шкале, чтобы применить для 4C ворота, чтобы убедиться, что три популяции находятся в непрерывном порядке в воротах. Далее создайте новую область рассеяния вперед по сравнению с участком плотности backscatter области в линейном масштабе, и выберите единый размер клеток в качестве чистой круглой популяции сперматозоидов.
После сортировки, репрезентативные чистоты разделенных лептотена, zygotene, пахитена и диплотена сперматозоидов фракций, как правило, между 80%до 90%, как это подтверждается SYCP3 и Гамма H2AX иммуностимуляторов. Чистота круглого сперматозоидов фракция может быть подтверждена ядром окрашивания с DCV в сочетании с Sp56 и H1t окрашивания, а также, как правило, около 90% жизнеспособность изолированных популяций клеток, как правило, более 95%И средняя общая урожайность каждой фракции от одной взрослой мыши, как правило, достаточно для различных вниз по течению анализа. Отсортированные клетки могут быть использованы для различных следующего поколения секвенирования анализа, чтобы лучше изучить экспрессию генов и регуляции во время сперматогенеза.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен простой метод выделения живых меиотических и постмеиотических половых клеток из семенников взрослых мышей. Используя краситель для связывания ДНК с низкой цитотоксичностью и метод сортировки клеток с помощью флуоресцентной активации (FACS), исследователи могут получать высокообогащенные популяции сперматогенных клеток для различных целей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Репродуктивная биология
Теоретическая часть
- Изоляция сперматогенных клеток имеет решающее значение для изучения мейоза и сперматогенеза.
- Современные методы могут обладать высокой цитотоксичностью, что ограничивает жизнеспособность клеток.
- Данный метод направлен на повышение жизнеспособности клеток в процессе изоляции.
- Гейтирование при проточной цитометрии является критически важным этапом этого процесса.
Цель исследования
- Разработать эффективный протокол выделения сперматоцитов и сперматид.
- Облегчить исследование молекулярных механизмов мейоза.
- Предложить детальную стратегию гейтирования для адаптации протокола к другим клеточным сортерам.
Используемые методы
- Выделение семенников взрослых самцов мышей.
- Использование красителя для связывания с ДНК с низкой цитотоксичностью, возбуждаемого фиолетовым светом.
- Применение флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS).
- Реализация детальной стратегии гейтирования при проточной цитометрии.
Основные результаты
- Успешное выделение живых мейотических и постмейотических половых клеток.
- Высокая степень обогащения популяций сперматогенных клеток.
- Демонстрация применимости метода к различным системам FACS.
- Предоставление простого и понятного протокола для исследователей.
Выводы
- Данный метод повышает жизнеспособность изолированных половых клеток.
- Он представляет собой ценный инструмент для изучения сперматогенеза.
- Будущие области применения могут включать исследование генетических и эпигенетических факторов мейоза.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Изоляция живых сперматогенных субпопуляций позволяет механистически снизить риски при выборе мишеней в репродуктивной биологии и поиске терапевтических средств, направленных на зародышевую линию. Данный метод повышает прогностическую достоверность валидации мишеней, обеспечивая получение жизнеспособных клеток высокой чистоты для последующих омиксных и функциональных анализов. Совместимость метода со стандартными платформами FACS с фиолетовым лазером расширяет доступность и масштабируемость рабочих процессов по поиску новых мишеней.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы в путях мейоза и сперматогенеза с использованием очищенных фракций сперматоцитов на стадиях лептотены/зиготены, пахитены и диплотены.
- Практическая ценность: предлагает метод окрашивания с низкой цитотоксичностью, совместимый с широко доступными клеточными сортерами с фиолетовым лазером, что снижает требования к оборудованию.
- Научная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет выделения живых клеток с жизнеспособностью >95% для последующего функционального анализа.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные о содержании ДНК (1C, 2C, 4C) с помощью окрашивания DCV, что обеспечивает стандартизированный гейтинг по плоидности для воспроизводимости анализа.
- Практическая ценность: облегчает приготовление суспензий одиночных клеток из семенников мыши, что является критически важным предварительным этапом для конвейеров скрининга на основе FACS.
- Научная ценность: позволяет получать высокоочищенные фракции сперматид и сперматоцитов (чистота 80–90%), подходящие для последующих согласованных приложений, таких как RNA-seq.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: предоставляет релевантную для патологии систему изучения генетических и эпигенетических регуляторов мейоза, обеспечивая согласованность между мишенями и гипотезами.
- Практическая ценность: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, предоставляя жизнеспособные половые клетки для изучения молекулярных механизмов.
- Научная ценность: способствует принятию обоснованных решений по продвижению разработки с учетом рисков за счет снижения неопределенности механизмов при валидации мишеней в зародышевой линии.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска — от проверки гипотез о мишенях до идентификации ведущих соединений, что особенно важно для разработки терапевтических средств, модулирующих зародышевую линию, где критическую роль играет клеточный контекст.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей за счет выделения определенных стадий мейоза для молекулярного профилирования.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа благодаря стандартизированным протоколам диссоциации и окрашивания, которые гарантируют стабильное качество клеточной суспензии.
- Аналитика: предоставляет количественные данные с разделением по плоидности с помощью флуоресценции DCV, что позволяет сравнивать состояния клеток при различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивают связь с доклинической работой, предоставляя модель на мышах, имеющую трансляционную значимость для сперматогенеза человека.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает применимый в различных проектах и для разных классов мишеней рабочий процесс, совместимый с FACS, для выделения живых половых клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности в валидации мишени за счет уточнения механизмов мейотического прогрессирования.
- Практическая ценность: Стандартизация и воспроизводимость за счет детальной стратегии гейтирования и использования красителей с низкой цитотоксичностью.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет снижения биологических рисков на поздних этапах в программах по репродуктивным мишеням.
- Влияние на портфель: Обеспечение приоритезации мишеней в зародышевой линии с учетом рисков на основе функциональной валидации в очищенных субпопуляциях клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт в установке гейтов при проточной цитометрии и компенсации флуоресценции для многопараметрического анализа DCV.
- Зависимость от наличия приборов FACS с возможностью возбуждения фиолетовым лазером (405 nm).
- Необходима стандартизация процесса диссоциации тканей и времени окрашивания для всех операторов и лабораторий.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации буфера для диссоциации и условий инкубации.
- Практическое ограничение: метод в настоящее время валидирован для семенников взрослых мышей; применимость к незрелым тканям или тканям человека требует дальнейшего изучения.
