Трансплантация 3D биопечатного патча в муринной модели инфаркта миокарда
26 сентября 2020 г.
Этот протокол направлен на пересадку 3D биопечатного патча на эпикардий инфарктных мышей, моделющих сердечную недостаточность. Она включает в себя подробную информацию об анестезии, хирургическое открытие грудной клетки, постоянная перевязка левой передней нисходящей (LAD) коронарной артерии и применение биопечатного патча на инфарктной области сердца.
Каждые 10 минут у кого-то в Австралии сердечный приступ. Это может оставить их с поврежденной сердечной мышцы, и что может привести к сердечной недостаточности. Мы обнаружили, что мы можем преобразовать стволовые клетки, из крови или кожи, в бьющимся клеткам сердца.
Затем, если мы поместим эти перепрограммированные клетки, через наш 3D биопринтер, используя биоинк, мы считаем, что мы можем сделать сердечные пятна с клетками, соответствующими собственным клеткам людей. Глубоко анестезированные мыши, используя кетамин ксилазин, интубирован с помощью 20 калибровочный катетер. После инортации трекера мышь аккуратно помещается на грелку, а затем подключается к аппарату искусственной вентиляции легких, который автоматически устанавливает целевой объем в зависимости от веса мыши.
Под легкой анестезией с использованием фтора 2%iso, мышь просто чиста с йодом и этанолом. Левая боковой торакотомия выполняется, чтобы разоблачить сердце. Втягиватель помещается между третьим и четвертым ребром.
Перикард тщательно разрезают. LAD определены под микроскопом. Для шага перевязки LAD, важно, чтобы избежать шва резки через LAD.
Таким образом, укрепляющий кусок 3.06 шелковый шов помещается на сердце, как показано, работает в том же направлении и только на вершине LAD. Используя шелковый шов 7.06, LAD изолирован и постоянно перевязан. Это позволяет бланшировать сердце, которое получает сердечный приступ.
Это приведет к реконструкции и левый желудочек потерпит неудачу с течением времени. 3D биопечать сердца патч генерируется в лаборатории с помощью 3D биопринтера. Это позволяет слой за слоем, осаждение сердечных клеток, используя сочетание клеток и гидрогелей.
Вы можете увидеть один плавающий в этом видео, а теперь на этом изображении. Вот изображение патч внешний вид, когда изображены эпифлуоресценции световой микроскопии в колодец из шести пластины хорошо. Патч был окрашен пятном Hoechst для ядер клеток, и это синее пятно также подчеркивая аутофторесцентные гидрогели.
Это нетронутый альгенат желатин патч подходит для трансплантации, похож на тот, который показан в видео. С помощью нашего метода, большинство патчей начали распадаться между 14 и 28 дней, в культуре, как показано здесь на этом изображении другого патча, который распался. Мы обнаружили, что оптимальное время для пересадки патчей было между днем семь и день 14 после биопечати.
Это было, когда патчи, содержащие сердечные клетки начали бить, показывая степень созревания тканей, но до патчи начали распадаться. Патч привозят в хирургическую комнату, и медленно и осторожно помещают поверх сердца в части мыши. Тщательно также перемещается в область вывода.
Опровержение медленно удаляется. Наконец, третье и четвертое ребра закрываются вместе с помощью 6,0 проленового шва. Вместе с мышцей ребра закрываются, после чего закрывается кожа.
После закрытия грудной клетки, мышь вводится с антиседан и фуросемид. Медленно, мышь будет восстановить независимую дыхательную активность, и будет реагировать на щипать ногой. Мышь внимательно контролируется, и как только она просыпается от анестезии, она помещается в свою собственную клетку.
Это изображение показывает, с принятой области, где биопечать патч будет сидеть на верхней части сердца мыши. В заключение, мы показали, что 3D биопечатные альгенатные желатиновые патчи могут быть пересажены нашим методом, на эпикардий, в мышиной модели инфаркта миокарда. В фазе биопечати, алгенат желатина гидрогели имеют отличную печать из-за их реологических свойств, что позволяет экструзии без повреждения клеток, но и с биомеханической прочности, чтобы сохранить свою структуру после 3D биопечати, и во время трансплантации.
Наш метод, вероятно, будет широко осуществим, а также подходит для тестирования нескольких групп 3D биопечатных патчей. Например, с разным клеточным содержимым.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол трансплантации биопечатного 3D-патча на эпикард мышей с инфарктом миокарда для моделирования сердечной недостаточности. Метод включает подробные этапы хирургического вмешательства и использование биопечатных патчей, созданных из кардиальных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Инженерия сердечной ткани
- 3D-биопечать
- Модели инфаркта миокарда
Теоретические основы
- Сердечные приступы могут привести к повреждению сердечной мышцы и сердечной недостаточности.
- Стволовые клетки могут быть перепрограммированы в сокращающиеся клетки сердца.
- 3D-биопечать позволяет создавать сердечные заплатки с использованием биочернил.
- Оптимальный выбор времени для трансплантации заплатки имеет решающее значение для успеха.
Цель исследования
- Разработать метод трансплантации биопечатных сердечных заплаток.
- Оценить возможность использования клеток пациента для создания заплаток.
- Оценить эффективность заплаток на мышиной модели инфаркта миокарда.
Используемые методы
- Использование кетамина и ксилазина для анестезии мышей.
- Левосторонняя латеральная торакотомия для обнажения сердца.
- Перманентное лигирование левой передней нисходящей коронарной артерии.
- Трансплантация 3D-биопринтированных патчей на сердце.
Основные результаты
- 3D-биопечатные патчи продемонстрировали хорошие показатели печатаемости и биомеханической прочности.
- Патчи начали разрушаться в период от 14 до 28 дней культивирования.
- Оптимальный период для трансплантации составил от 7 до 14 дней после биопечати.
- Данный метод подходит для тестирования различных составов биопечатных патчей.
Выводы
- 3D-биопринтинговые альгинат-желатиновые заплаты могут быть успешно трансплантированы.
- Данный метод, вероятно, найдет широкое применение в исследованиях сердечно-сосудистой системы.
- В будущих исследованиях можно изучить различные клеточные составы для улучшения результатов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Данный протокол устраняет критический пробел в исследованиях регенерации сердца: проблему надежного тестирования in vivo терапевтических патчей, созданных с помощью 3D-биопечати, на моделях инфаркта миокарда у мышей. Снижая вариативность процедур и уровень смертности, связанных с хирургической трансплантацией, этот метод позволяет проводить более статистически достоверную доклиническую оценку инженерных тканей. Данное достижение способствует снижению рисков при разработке биопрепаратов и биоматериалов на ранних стадиях за счет повышения воспроизводимости исследований по функциональной валидации.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проводить функциональную оценку биопечатных заплаток в соответствующей заболеванию ишемизированной микросреде для проверки механистических гипотез приживаемости тканей и паракринной сигнализации.
- Практическая ценность: Стандартизирует хирургическое введение сложных биопрепаратов, снижая межидивидуальную вариабельность эффективности приживления у животных.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает воспроизводимую платформу для сравнения составов патчей (например, типов клеток, соотношений гидрогелей) на основе показателей структурного сохранения и интеграции.
- Практическая ценность: Поддерживает среднепропускной скрининг перспективных биоматериалов, обеспечивая единообразное хирургическое введение во всех когортах исследования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает лонгитюдную оценку опосредованного патчем ремоделирования желудочков и функционального восстановления в клинически значимой модели ишемического повреждения.
- Практическая ценность: позволяет проводить исследования с достаточной статистической мощностью и сниженным уровнем потерь образцов, что повышает осуществимость экспериментов по оптимизации дозировки и временных интервалов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от поиска мишени до доклинических исследований, обеспечивая стандартизированную доставку сконструированных тканей после валидации мишени и перед скринингом эффективности на моделях заболеваний.
- Биология открытий: Оказывает поддержку при проверке гипотез о выживаемости клеток, приживлении и секреции биоактивных факторов в инфарктном миокарде.
- Скрининг: Позволяет проводить количественное сравнение различных вариантов патчей с помощью стандартизированной хирургической имплантации и посттрансплантационного мониторинга.
- Аналитика: Обеспечивает получение гистопатологических и функциональных показателей (например, размера инфаркта, толщины стенки) для ранжирования эффективности патчей.
- Трансляционные исследования: Связывает показатели созревания in vitro с функциональными результатами in vivo для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую хирургическую платформу для оценки различных кандидатов для регенерации сердца в рамках разных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов в доклинических моделях за счет снижения влияния хирургических вмешивающихся факторов.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость сложных процедур трансплантации тканей.
- Стратегическая ценность: Снижает уровень биологического шума при оценке эффективности, что способствует принятию более четких решений о продолжении или прекращении разработки на ранних этапах.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию кандидатов для регенерации миокарда с учетом рисков на основе более надежных доклинических данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения кардиохирургических операций на мышах, применения анестезии и послеоперационного ухода.
- Необходимо наличие инструментов для микрохирургического шитья, аппаратов ИВЛ и стереомикроскопов для точного лигирования LAD.
- Требуется стандартизация протоколов манипулирования патчами и их позиционирования для всех операторов.
- Необходимо учитывать вариабельность сроков созревания патча в зависимости от источника клеток и состава гидрогеля.
- Метод ограничен моделями острого и подострого повреждения; не подходит для изучения хронической ишемии без адаптации модели.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Surgical Procedure
1:18
Preparing the Surgical Field
1:31
Left Lateral Thoracotomy
2:00
Left Anterior Descending (LAD) Permanent Coronary Artery Ligation
2:58
3D Bioprinting and Culturing Patches (7-14 days before transplantation)
4:19
Transplantation of the Bioprinted Patch onto the Epicardium
5:39
Mouse Recovery
6:29
Representative Results
6:45
Conclusion
