Ex Vivo Choroid Прорастание анализ глазного микрососудистого ангиогенеза
6 августа 2020 г.
Этот протокол представляет собой анализ прорастания хороидов, ex vivo модель микрососудистого пролиферации. Этот анализ может быть использован для оценки путей, участвующих в распространении хороидных микро-сосудов и оценки лечения наркотиков с использованием дикого типа и генетически модифицированных тканей мыши.
Этот анализ сосудистой оболочки глаза обладает высокой воспроизводимостью и имеет отношение к исследованиям ангиогенеза хориоидеи и возрастной макулярной дегенерации, ВМД. Он может дополнить исследования микрососудистого поведения in vivo. Этот анализ может быть использован для скрининга соединений в качестве потенциальных методов лечения неоваскулярной ВМД или для оценки путей, участвующих в неоваскуляризации хориоидеи с использованием дикого типа и генетически модифицированной ткани мыши. Для начала добавьте пять миллилитров пенициллина, стрептомицина и 10 и пять миллилитров коммерчески доступных добавок к 500 миллилитрам полной классической среды с сывороткой, затем добавьте 50 миллилитров среды, разморозьте экстракт базальной мембраны или BME в течение ночи в холодильнике при температуре от двух до восьми градусов Цельсия.
Выложите аликвоту полного классического медиума на лед. Очистите препарирующий микроскоп, щипцы и ножницы 70% этанолом. Приготовьте к культивированию клеток чашки и поместите одну на диссекционный микроскоп, а другую на лед.
Затем добавьте в каждое блюдо по 10 миллилитров полной классической среды. Перед вскрытием держите глаза в полной классической среде на льду. Удалите соединительную ткань и зрительный нерв, затем с помощью микроножниц сделайте надрез по окружности на 0,5 миллиметра позади роговицы Лимб.
Удалите роговицу радужной оболочки комплекса, стекловидного тела и к хрусталику. Сделайте разрез в один миллиметр перпендикулярно краю разреза по направлению к зрительному нерву и разрежьте окружную полосу шириной в один миллиметр, затем разделите центральную и периферическую области комплекса. Используйте щипцы для отшелушивания сетчатки от склерного комплекса РПЭ сосудистой оболочки
.Держите периферическую бандаж сосудистой оболочки в полной классической среде на льду. Изолируйте другой глаз и повторите процесс, чтобы вырезать вторую ленту. Разрежьте круглую ленту на пять-шесть примерно равных квадратных частей.
Добавьте по 30 микролитров размороженного БМЭ в центр каждой лунки 24-луночного планшета для культуры тканей. Следите за тем, чтобы капля BME образовывала выпуклый купол в нижней части пластины, не касаясь краев. Поместите салфетку в середину BME.
Не расплющивайте растение Х сосудистой оболочки. Дайте ткани расшириться внутри БМЭ. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы гель застыл, затем добавьте 500 микролитров полной классической среды в каждую лунку.
Меняйте классическую среду через день. Прорастание сосудистой оболочки глаза можно наблюдать уже через три дня с помощью микроскопа. Откройте изображение прорастания сосудистой оболочки с изображением J и проверьте изображение, введите и восемь бит с оттенками серого.
Затем оптимизируйте контраст, выбрав изображение, отрегулируйте, яркость контраста и отрегулируйте его. Используйте функцию волшебной палочки, чтобы очертить и удалить ткань сосудистой оболочки, которая присутствует в центре ростков. Удалите фон изображения с помощью бесплатных инструментов выделения.
Затем перейдите к изображению, настройте порог и используйте функцию порога, чтобы определить микрососудистые ростки на фоне по периферии. Нажмите F2, и появится сводка. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы сохранить изображение выбранной области в той же папке, что и исходное изображение, для использования в будущем.
После того, как группа образцов будет измерена, скопируйте записанные данные для анализа. Этот протокол был использован для изучения и количественного определения прорастания сосудистой оболочки у C 57, черных шести мышей J с третьего по шестой день. В репрезентативном случае площадь прорастания хориоидеи составляла 0,38, 1,47, 5,62 и 10,09 миллиметров в квадрате на третий, четвертый, пятый и шестой дни соответственно.
Влияние потери FFAR4 на прорастание сосудов хориоидеи оценивали с помощью анализа прорастания сосудистой оболочки у четырех мышей нокаутного типа FFAR4 и мышей дикого типа FFAR4. Площадь прорастания у мышей с нокаутом FFAR4 увеличивала рост сосудов хориоидеи по сравнению с FFAR4 дикого типа на шестой день. Кроме того, лечение одним микромолярным агонистом FFAR4 уменьшило область прорастания хориоидеи по сравнению с необработанными мышами на шестой день.
Этот анализ позволяет воспроизводимо оценить антиангиогенный потенциал фармакологических соединений и варьировать роль специфических путей в неоваскуляризации хориоидеи с использованием генетически модифицированной ткани мышей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлен метод анализа прорастания хориоидеи в качестве модели ex vivo для изучения микрососудистой пролиферации, в частности, в контексте хориоидального ангиогенеза и неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Этот анализ позволяет оценивать пути, участвующие в пролиферации микрососудов хориоидеи, а также эффективность лекарственных препаратов с использованием тканей мышей как дикого типа, так и генетически модифицированных.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Хориоидальный ангиогенез
- Возрастная макулярная дегенерация (ВМД)
- Поведение микрососудов
Теоретические основы
- Значение хориоидального ангиогенеза при заболеваниях глаз
- Модели ex vivo, дополняющие исследования in vivo
- Генетически модифицированные мышиные модели для более глубокого изучения
Используемые методы
- Анализ прорастания сосудов хориоидеи
- Использование тканей мышей дикого типа и генетически модифицированных линий
- Микроскопия для наблюдения за прорастанием сосудов хориоидеи
Основные результаты
- Метод анализа позволяет проводить воспроизводимые измерения прорастания хориоидальных сосудов в течение нескольких дней
- Отсутствие FFAR4 у мышей с нокаутом приводило к усилению роста сосудов хориоидеи по сравнению с диким типом
- Применение агониста FFAR4 уменьшало площадь прорастания хориоидальных сосудов у мышей с нокаутом
Выводы
- Исследование демонстрирует эффективность анализа в оценке антиангиогенного потенциала фармакологических соединений
- В работе подчеркивается роль специфических сигнальных путей в хориоидальной неоваскуляризации
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Метод анализа прорастания сосудов хориоидеи ex vivo представляет собой воспроизводимую модель для оценки пролиферации микрососудов хориоидеи, что имеет непосредственное значение для поиска лекарственных средств против неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД). Данный метод позволяет снизить механистические риски при изучении ангиогенных путей с использованием тканей мышей дикого типа и генетически модифицированных мышей, что способствует валидации мишеней и идентификации ведущих соединений в рамках офтальмологических разработок. Этот анализ связывает фундаментальную биологию и доклиническую оценку путем количественного определения динамики прорастания сосудов в физиологически релевантной системе эксплантатов тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем измерения прорастания сосудов хориоидеи в ответ на генетическую или фармакологическую модуляцию ангиогенных путей.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию таких мишеней, как FFAR4, в контексте многоклеточной ткани, включающей эндотелий, макрофаги, перициты и РПЭ.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов за счет количественной оценки дозозависимого влияния соединений на прорастание микрососудов в динамике.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные результаты визуализации площади прорастания, которые отражают формирование микрососудистой сети в контролируемых условиях.
- Практическая ценность: Использование стандартизированного посева эксплантатов в BME с пониженным содержанием факторов роста и четко определенного графика смены среды обеспечивает воспроизводимость результатов в различных экспериментах.
- Масштабируемость: Совместимость с форматом 24-луночных планшетов и полуавтоматизированным анализом в ImageJ позволяет проводить скрининг соединений со средней и высокой пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Сохраняет естественную архитектуру хориоидеи-РПЭ-склеры, поддерживая межклеточные взаимодействия, которые имеют решающее значение для моделирования патофизиологического ангиогенеза.
- Практическая ценность: Позволяет проводить прямое сравнение тканей дикого типа и нокаутных тканей (например, FFAR4) для выявления генетического вклада в фенотипы прорастания сосудов.
- Прогностическая ценность: Обеспечивает возможность оценки эффектов агонистов/антагонистов на прорастание сосудов, предоставляя доклинические доказательства модуляции сигнального пути.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод анализа вписывается в континуум офтальмологических исследований — от валидации мишени и оптимизации ведущих соединений до доклинических испытаний эффективности, особенно в рамках антиангиогенных стратегий лечения ВМД.
- Открывательная биология: позволяет проверять гипотезы о регуляторах ангиогенеза путем количественного определения изменений в прорастании сосудов в ответ на ингибирование или активацию сигнального пути.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели прорастания, что позволяет ранжировать эффекты соединений в тканевом формате.
- Аналитика: предоставляет измерения площади с временным разрешением (например, с 3-го по 6-й день), что позволяет проводить кинетический анализ микрососудистых ответов.
- Трансляционные исследования: использует релевантные заболеванию эксплантаты для моделирования хориоидальной неоваскуляризации, что облегчает экстраполяцию на модели ВМД in vivo.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную, многократно используемую платформу для оценки множества соединений или генетических моделей в рамках различных проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, связывая генетические или фармакологические воздействия с количественными результатами прорастания в контексте нативной ткани.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов выделения ткани, высева на BME, замены среды и визуализации.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки («go/no-go»), предоставляя ранние доказательства антиангиогенной активности на уровне ткани перед началом испытаний in vivo.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию соединений с учетом рисков на основе данных о дозозависимом ответе и генетической валидации.
Особенности реализации
- Требуется опыт диссекции тканей мыши и выделения эксплантатов в стерильных условиях.
- Необходим доступ к экстракту базальной мембраны (BME) с пониженным содержанием факторов роста и фазово-контрастному микроскопу.
- Требуются стандартизированные рабочие процессы анализа изображений (например, макрос ImageJ) для согласованного количественного определения прорастания.
- При интерпретации показателей прорастания необходимо учитывать вариабельность размера эксплантатов и жизнеспособности тканей.
- Метод ограничен тканями мыши; межвидовые различия могут повлиять на переносимость результатов на биологию хориоидеи человека.
