Одноклеточный анализ транскрипционно активных аллелей одной молекулой FISH

SM FISH точно определяет уровни и локализацию специфической РНКазы. Этот метод особенно полезен для анализа межклеточного анализа и аллели по вариации аллелей в РНК. Транскрипция генов является важным процессом в клеточной биологии, SM FISH позволяет исследовать содержание РНК в ответ на внешние стимулы на уровне отдельной клетки и предоставлять пространственную информацию.

После лечения агонистами рецепторов эстрогена промойте клетки холодным стерильным PBS с кальцием и магнием и зафиксируйте клетки 500 микролитрами фиксирующего буфера на 30 минут на льду. В конце инкубации промойте клетки два раза холодным стерильным PBS с кальцием и магнием в течение трех минут, прежде чем добавить 500 микролитров 70%-ного этанола в каждую лунку. Затем запечатайте 24-луночную пластину парафиновой полиэтиленовой пленкой и поместите пластину на вращатель при температуре четыре градуса Цельсия на срок не менее четырех и до 16 часов.

Для гибридизации РНК FISH в конце инкубации клетки однократно промывают 500 микролитрами буфера 2X SSC с добавлением 10% формамида в течение пяти минут при комнатной температуре на ротаторе. Во время инкубации поместите кусок полиэтиленовой пленки неоткрытой стороной вверх в стеклянную чашку Петри, очищенную с помощью РНК обеззараживающей поверхности, и положите на стерильные пропитанные водой бумажные полотенца по краям чашки. В конце инкубации равномерно распределите 30 микролитров капель свежеприготовленного буфера для зонда GREB1 интрона и экзона GREB1 на чистую сторону парафиновой пленки и с помощью стерильных щипцов аккуратно поместите одну защитную полоску клеток клеточной стороной вниз на каждую каплю без пузырьков.

Запечатав тарелку парафиновой полиэтиленовой пленкой, накройте тарелку фольгой и выдержите тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на ровной невращающейся поверхности. На следующее утро с помощью щипцов верните защитные стекла на 24-луночную сторону ячейки планшета вверх в течение двух 15-минутных промывок в 500 микролитрах свежего буфера 2X SSC с добавлением 10% формамида на промывку при 37 градусах Цельсия на нагретом ротаторе. После второй промывки окрашивайте ДНК одним микрограммом на миллилитр DAPI в буфере 2X SSC в течение 10 минут при комнатной температуре на ротаторе, а затем в течение пяти минут промывайте в буфере 2X SSC при комнатной температуре.

Используйте бумажное полотенце, чтобы удалить избыток буфера 2X SSC, и промойте образцы в воде без нуклеаз, чтобы удалить избыток солей. Затем с помощью незатвердевающего монтажного носителя закрепите защитные стекла на стеклянных предметных стеклах и заклейте защитные стекла прозрачным лаком для ногтей. Для получения изображений образца загрузите предметное стекло с максимальной ожидаемой интенсивностью на предметный столик для эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенный объективом с 60 или 100-кратным увеличением масла в камере sCOMS, и поместите каплю иммерсионного масла на объектив.

Для получения Zstack сфокусируйтесь на образце в канале DAPI и выберите верхнюю и нижнюю части Zstack на расстояниях, на которых окрашенные DAPI ядра становятся не в фокусе. Используйте слайд для оптимизации количества освещения от источника света и времени экспозиции для каждого канала, а также для получения изображений со всех слайдов в условиях, исключающих обесцвечивание фотографий и/или насыщенность пикселей камеры. После получения изображения используйте 10 циклов агрессивного восстановительного алгоритма, чтобы деконволюционировать изображения и сохранить все проекционные изображения в соответствии с битовой глубиной используемой камеры.

Для анализа изображений сначала загрузите Jupiter Notebook с GitHub и установите Python Anaconda Distribution версии 3.6 или выше. Откройте командную строку Anaconda и введите команду установки, чтобы установить SimpleITK для Anaconda. Откройте Anaconda Navigator и запустите Jupiter Notebook.

Откроется веб-браузер с каталогами и файлами. Просмотрите структуры каталогов, чтобы получить доступ к каталогу, содержащему загруженный Jupiter Notebook с GitHub. Затем откройте блокнот и нажмите клавиши Shift и Enter, чтобы запустить каждую ячейку.

В этом репрезентативном эксперименте адгезивные клетки рака молочной железы обрабатывались агонистом рецепторов эстрогена или носителем в течение 24 часов. Спектрально разделенные наборы зондов на основе интронных и экзонных последовательностей GREB1 позволили одновременно визуализировать и количественно оценить зарождающиеся и зрелые мРНК. Важно отметить, что количество транскрипционно активных аллелей в каждой клетке, которые, как было показано, являются частью времени реакции на эстроген, может быть отмечено.

Подсчитав перекрывающиеся пятна интрона и экзона, было установлено, что клетки, обработанные E2, имеют в четыре раза увеличенную долю клеток, которые демонстрируют два или более активных аллеля GREB1, по сравнению с клетками, обработанными носителями. Поскольку интроны сплайсируются из зарождающейся мРНК для получения зрелой мРНК, состоящей только из последовательностей экзонов, количество зрелых мРНК на клетку можно подсчитать, количественно оценив количество зеленых пятен. Построение графиков этих данных позволяет затем наблюдать сдвиг в распределении зрелых клеток мРНК GREB1 и совокупное изменение в популяции клеток после обработки E2.

C-FISH позволяет последовательно исследовать несколько видов РНК, MERFISH — это метод штрихкодирования для значительного увеличения мультиплексирования, а iFISH используется для одновременного изучения РНК и белков.