Субретинальная трансплантация ткани сетчатки, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека, на модели крупного крупного животного кошки

Текущий протокол подробно показывает субретинальную доставку целых органоидов сетчатки на модели крупного животного с целью разработки подходов клеточной терапии для дегенерации сетчатки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет доставлять органоиды непосредственно в ткань-мишень, сетчатку. Этот метод направлен на лечение прогрессирующих дегенеративных состояний сетчатки, таких как возрастная макулярная дегенерация, пигментный ретинит или врожденный амавроз Лебера.

Демонстрировать процедуру будет доктор Петерсон Джонс. Для субретинальной имплантации органоидов используйте ножницы для тенотомии Стивенса, чтобы выполнить боковую кантотомию толщиной от 0,5 до 1 сантиметра у четырехмесячной кошки, находящейся под наркозом натощак, и поместите в разрез зеркало век Барракера соответствующего размера, чтобы веки оставались открытыми, а ассистент хирурга регулярно орошает роговицу BSS на протяжении всей процедуры. Используйте щипцы для связывания роговицы 0,5 Castroviejo и небольшой противомоскитный гемостат, чтобы осторожно захватить бульбарную конъюнктиву рядом с лимбом.

Поместите два шелковых шва 6-0 в конъюнктиву, непосредственно прилегающую к лимбу в положениях «4 часа» и «8 часов», чтобы удерживать глаз в первичном взгляде и втягивать третье веко. Зажмите концы швов небольшими противомоскитными гемостатами, чтобы облегчить их манипуляцию, и наложите еще один шов в положении «12 часов» в лимбе частично через толщу лимба, стараясь не проникнуть в глаз. Неплотно завяжите шов, коротко обрезав конец, и наложите шов на конъюнктиву, непосредственно прилегающую к лимбусу, в положении «4 часа», чтобы удерживать глаз и основной взгляд.

Отразите бульбарную конъюнктиву между 10 и 2 часами и используйте ножницы для тенотомии, чтобы надрезать конъюнктиву в двух-трех миллиметрах от лимба. Подорвите конъюнктиву и очистите капсулу Тенона, чтобы обнажить склеру в двухчасовом и 10-часовом портах витрэктомии в трех-пяти миллиметрах от лимба. Используйте штангенциркуль, чтобы определить места для склеротомии, избегая основных склеральных сосудов, которые могут быть видны у кошки.

Планируя трехмиллиметровую область в 10-часовом инструментальном порту для хирурга-правши, предварительно наложите полиглактиновые крестообразные швы 6-0 или 7-0 без завязывания в местах предполагаемой склеротомии. После того, как швы будут на месте, попросите помощника взяться за 12-часовые швы, чтобы помочь удерживать глобус в нужном положении, и используйте 0,12-миллиметровые щипцы Кастровьехо, чтобы удерживать ткань рядом с местом склеротомии. Использует троакар для введения порта для витрэктомии 23 калибра через склеру как в положении «2», так и в положении «10 часов» под углом к зрительному нерву, чтобы избежать контакта с хрусталиком, и использует вязные щипцы, чтобы осторожно нажать на порт для орошения, чтобы определить, можно ли визуализировать кончики в стекловидном теле.

Попросите ассистента поместить увеличительную ирригационную витрэктомию Machemer на роговицу, чтобы можно было визуализировать задний сегмент глаза, и резак для витрэктомии 23 калибра через порт инструмента для выполнения частичной витрэктомии. Затем вводят иглу одномиллилитрового шприца, содержащего один миллилитр раствора триамцинолона, в порт прибора и вводят от 250 до 500 микролитров кристаллической суспензии. Когда раствор будет доставлен, продвиньте зонд для витрэктомии через порт инструмента так, чтобы он приблизился к головке зрительного нерва так, чтобы порт был обращен в сторону от поверхности сетчатки.

Используйте высокий вакуум, чтобы отделить витреальное лицо от сетчатки, вставьте инжектор через порт инструмента к поверхности сетчатки и выдавите наконечник канюли. Осторожно нажмите на кончик поверхности сетчатки и попросите помощника слегка быстро нажать на поршень шприца, чтобы начать отслоение сетчатки, уменьшая давление инъекции, чтобы обеспечить медленное увеличение отслойки сетчатки до тех пор, пока не будет достигнут желаемый размер. Используйте канюлю 41 калибра инжектора, чтобы немного увеличить отслойку, пока не будут введены ножницы сетчатки, и удалите 10-часовой склеральный порт.

Затем используйте прямой нож с прорезью 2.850 мм, ориентированный на зрительный нерв, чтобы избежать прикосновения к хрусталику, чтобы увеличить склеротомию в этом месте. Сделайте ретинотомию на пузыре вдали от зрительного нерва, чтобы избежать повреждения нервных волокон сетчатки, происходящих из трансплантированной области, и избегайте перерезания крупных сосудов сетчатки, чтобы снизить риск кровоизлияния. Чтобы имплантировать органоиды, вставьте стеклянный капилляр, загруженный органоидами, через увеличенную склеротомию к месту ретинотомии и используйте кончик капилляра, чтобы слегка открыть ретинотомию, чтобы обеспечить доступ к отверстию субретинального пузыря.

Попросите помощника снова медленно нажать на поршень инжектора, чтобы ввести органоиды в субретинальный пузырь. BSS следует провести органоиды, органы и промыть ретинотомию. Когда все органоиды будут доставлены, оставьте стеклянный капилляр на месте на несколько секунд, прежде чем медленно удалить капилляр из глаза, стараясь избежать внезапного выброса жидкости.

Когда капилляр будет удален, закройте склеротомию, используя предварительно наложенный шов крестообразным узором. Попросите помощника удалить инфузионный порт, быстро завязать шов для склеротомии и закрыть перитомию полиглактиновыми швами по простому непрерывному рисунку. Закройте латеральную кантотомию полиглактиновым швом 6-0 и кожными швами в виде восьмерки, чтобы выполнить боковой кантус, и используйте простые прерывистые кожные швы, чтобы закрыть остальную часть раны.

Затем введите соответствующий послеоперационный коктейль стероидов и антибиотиков. Нагрузка на органоиды сетчатки, полученная из плюрипотентных стволовых клеток человека, может быть подтверждена в стеклянной канюле инъекционного устройства и во время операции с помощью прямой визуализации. Наличие органоидов в субретинальном пространстве может быть подтверждено в послеоперационном периоде с помощью офтальмологического обследования и визуализации глазного дна.

Перед эвтаназией также могут быть выполнены конфокальная сканирующая лазерная офтальмоскопия и оптическая когерентная томография в спектральной области для оценки положения органоидов. Эти методы могут быть использованы для демонстрации персистенции органоидов сетчатки в субретинальном пространстве между нервной сетчаткой и пигментным эпителием сетчатки глаза-реципиента. Гистологический и иммуногистохимический анализы могут быть использованы для иллюстрации выживаемости ксеногенных графиков в субретинальном пространстве большого глаза у животного с ослабленным иммунитетом.

Только специалисты по витреоретинальной хирургии, такие как обученные ветеринарные офтальмологи или витреоретинальные хирурги, знакомые с видовыми различиями в кошачьем глазу по сравнению с человеческим глазом, должны выполнять эту процедуру. Методика, представленная в этом видео, должна быть применима и к другим моделям крупных животных, которые используются для перевода витреоретинальных хирургических техник в клиники.