Выделение проксимальных жидкостей для исследования микроокружения опухоли аденокарциномы поджелудочной железы
5 ноября 2020 г.
Панкреатический сок является ценным источником биомаркеров рака поджелудочной железы человека. Здесь описан метод интраоперационной процедуры сбора. Чтобы преодолеть проблему принятия этой процедуры в мышиных моделях, мы предлагаем альтернативный образец, опухолевую интерстициальную жидкость, и описываем здесь два протокола для ее выделения.
Описанный здесь метод выделения проксимальной жидкости как у человека, так и у мышей, может быть применен для изучения микроокружения рака поджелудочной железы с целью выявления новых биомаркеров заболевания. Используя этот простой протокол, можно перевести клинические данные из поджелудочного сока в мышиные модели PDAC для проведения механистических исследований. Сок поджелудочной железы является в значительной степени неизученной жидкостью организма, которая показала себя многообещающим источником ценных биомаркеров, помогающих в предоперационной диагностике и профилировании пациентов.
Я продемонстрирую первую часть протокола, а вторую часть протокола продемонстрирует Мариалуиса Барбагалло, постдок из нашей лаборатории. Оцените расположение протока поджелудочной железы с помощью измерений, полученных во время визуализации. Затем пальпируйте переднюю поверхность поджелудочной железы, чтобы определить ее точное местоположение.
Придерживайте головку поджелудочной железы в двенадцатиперстной кишке снизу, а левой рукой поднимите ее, отмечая первым пальцем расположение протока поджелудочной железы. Используйте правую руку, чтобы ввести трехмиллилитровый шприц с иглой 25-го калибра в поджелудочную железу, дистальнее большого пальца левой руки. Определите глубину проникновения и степень наклона иглы на основе предоперационных измерений и ощущения проникновения в стенку протока.
Выведите сок с помощью шприца. Если извлечь сок не удается, переместите иглу в попытке канюлировать проток поджелудочной железы. Как только поджелудочный сок будет извлечен, переместите его за пределы стерильного поля и перенесите в вакуумную пробирку ЭДТА объемом три миллилитра ЭДТА.
Держите пробирку при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока образец не будет передан в лабораторию. Чтобы обработать сок поджелудочной железы, центрифугируйте его при температуре 400 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы удалить любые клетки или мусор. Восстановите надосадочную жидкость, выделите ее и храните при температуре 80 градусов Цельсия до дальнейших анализов.
Чтобы изолировать опухолевую интерстициальную жидкость или TIF, путем центрифугирования разрежьте опухоль пополам, промойте две части в PBS и аккуратно промокните их на фильтровальной бумаге, двигаясь как можно быстрее, чтобы избежать испарения из опухоли. Немедленно перенесите опухоль в нейлоновый клеточный фильтр толщиной 20 микрометров, прикрепленный к конической трубке объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте пробирку при 400 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Извлеките TIF со дна пробирки, затем аликвотируйте его и сразу же заморозьте на сухом льду. Хранить при температуре 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа. Чтобы выделить ТИФ с помощью элюирования, разрежьте опухоль на небольшие кусочки ножницами или скальпелем, и тщательно промойте их холодным ПБС.
Переложите кусочки опухоли в пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 500 микролитров PBS с коктейлем ингибиторов протеазы, чтобы избежать деградации аналитов. Инкубируйте ткань в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра и выполните ряд этапов центрифугирования при температуре четыре градуса Цельсия, чтобы удалить любые клетки из образца.
Восстановление надосадочной жидкости после каждого центрифугирования и перенос ее в новую пробирку. После последнего центрифугирования немедленно аликвотировать и заморозить образец ТИФ на сухом льду. Храните его при температуре 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа.
Этот протокол был использован для получения панкреатического сока у пациентов с PDAC и другими доброкачественными заболеваниями поджелудочной железы. После фильтрации широких ЯМР-сигналов макромолекул стали очевидны сигналы от метаболитов с малой молекулярной массой. Контролируемый анализ OPLS-DA показал, что метаболический профиль в соке поджелудочной железы способен различать пациентов с PDAC и без PDAC с точностью до 82,4%Интересно, что метаболомный анализ, проведенный на образцах плазмы у тех же пациентов, не показал такой же дискриминантной силы.
Чтобы продемонстрировать, что содержание опухолевой интерстициальной жидкости достоверно отражает изменения в микроокружении опухоли, мышам подкожно вводили две линии клеток рака поджелудочной железы с противоположными гликолитическими скоростями. После удаления опухолей количественно определяли концентрации глюкозы и лактата. Опухолевая интерстициальная жидкость из высокогликолитических опухолей содержала меньше глюкозы и больше лактата по сравнению с опухолями с низким гликолитом.
В этом исследовании мы провели метаболомный анализ. Тем не менее, эти проксимальные жидкости подходят для многих других последующих применений, таких как масс-спектрометрия и профилирование микроРНК.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод интраоперационного сбора панкреатического сока, который является ценным источником биомаркеров рака поджелудочной железы. Кроме того, представлен альтернативный образец — интерстициальная жидкость опухоли, а также протоколы ее выделения на мышиных моделях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Онкология
- Поиск биомаркеров
Теоретические сведения
- Панкреатический сок недостаточно изучен в качестве источника биомаркеров.
- Он обладает потенциалом для помощи в предоперационной диагностике.
- Понимание микроокружения рака поджелудочной железы имеет решающее значение.
- Перенос результатов исследований на людях на мышиные модели может расширить возможности проведения исследований.
Цель исследования
- Выделение панкреатического сока и интерстициальной жидкости опухоли для идентификации биомаркеров.
- Предоставление протоколов, применимых как для моделей на людях, так и на мышах.
- Обеспечение условий для изучения механизмов развития рака поджелудочной железы.
Используемые методы
- Интраоперационный сбор панкреатического сока.
- Выделение интерстициальной жидкости опухоли.
- Методы визуализации для локализации главного панкреатического протока.
- Пальпация поджелудочной железы для точной идентификации.
Основные результаты
- Продемонстрированы протоколы выделения биологических жидкостей.
- Подчеркнут потенциал панкреатического сока как источника биомаркеров.
- Показана возможность переноса клинических данных на мышиные модели.
- Создан фундамент для будущих исследований механизмов.
Выводы
- Панкреатический сок и интерстициальная жидкость опухоли являются перспективными объектами для исследования биомаркеров.
- Данные протоколы могут углубить понимание рака поджелудочной железы.
- Для полного раскрытия потенциала этих жидкостей необходимы дальнейшие исследования.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Изоляция проксимальной жидкости позволяет напрямую исследовать микроокружение аденокарциномы поджелудочной железы, открывая путь к поиску биомаркеров, которые связывают клинические наблюдения с доклиническими механистическими исследованиями. Предоставляя технически доступные методы сбора панкреатического сока и интерстициальной жидкости опухоли как в системах человека, так и в мышиных моделях, данный протокол способствует валидации мишеней и разработке анализов, направленных на изучение изменений микроокружения. Такой подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, позволяя получать релевантные жидкости, отражающие взаимодействие стромальных и опухолевых клеток, что помогает в принятии решений о целесообразности дальнейшей разработки препаратов для лечения рака поджелудочной железы.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем выделения жидкостей, в которых концентрируются биомаркеры микроокружения опухоли.
- Практическая ценность: предоставляет релевантную заболеванию систему для функциональной валидации мишеней с использованием биомаркеров проксимальной жидкости.
- Научная ценность: способствует снижению механистических рисков за счет сравнительного анализа гликолитических фенотипов опухоли путем количественного определения глюкозы и лактата в TIF.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических жидкостей для последующего применения, такого как масс-спектрометрия и профилирование microRNA.
- Практическая ценность: Предоставление стандартизированных, воспроизводимых протоколов выделения (центрифугирование и элюция), подходящих для масштабирования анализа.
- Научная ценность: Получение количественных данных о метаболитах, которые позволяют осуществлять готовый к скринингу поиск биомаркеров с разделительной способностью (точность 82.4% в OPLS-DA).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: обеспечивает непрерывность систем исследования патологии путем экстраполяции данных о составе панкреатического сока человека на модели TIF мышей.
- Практическая ценность: упрощает доклиническую валидацию за счет выделения TIF из моделей подкожных опухолей, отражающих изменения микроокружения.
- Стратегическая ценность: поддерживает принятие обоснованных с учетом рисков решений о дальнейшем продвижении исследования путем установления связи между профилями жидкостных биомаркеров и фенотипом опухоли.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в общий процесс разработки лекарств — от ранней валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая профилирование микроокружения, которое служит основой для механистических исследований и скрининговых кампаний на базе биомаркеров.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов путем выделения жидкостей, отражающих стромально-опухолевые взаимодействия при PDAC.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного выделения TIF и панкреатического сока, позволяющего получить количественные данные о метаболитах и нуклеиновых кислотах.
- Аналитика: предоставляет измеримые биомаркеры (глюкоза, лактат, метаболиты) для сравнительного анализа состояний и фенотипического скрининга.
- Трансляционные исследования: связывают фундаментальные открытия с доклиническими исследованиями, демонстрируя, что TIF отражает гликолитическое состояние опухоли в мышиных моделях.
- Корпоративное повторное использование: создает воспроизводимую методику выделения проксимальных жидкостей в системах человека и мыши, снижая барьеры при переносе данных между моделями.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет детекции биомаркеров микроокружения и валидации мишеней при PDAC.
- Операционная ценность: Стандартизация и воспроизводимость благодаря использованию простых методов центрифугирования и элюирования для изоляции TIF.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем установления связи между жидкостными биомаркерами и фенотипом опухоли, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков на основе дискриминационных профилей жидкостных биомаркеров (точность 82,4% при разграничении PDAC и не-PDAC).
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с хирургическими жидкостями и препарированием опухолей для изоляции проксимальной жидкости.
- Необходимо наличие оборудования для центрифугирования (400 G, 4°C) и соблюдение условий стерильности при работе с панкреатическим соком и TIF.
- Требуется междисциплинарная стандартизация между хирургической, патологоанатомической и аналитической группами для обеспечения целостности образцов.
- Предусматривается адаптация методов изоляции TIF у мышей посредством центрифугирования или элюции в зависимости от размера ткани и целей последующего анализа.
- Учитываются практические ограничения, такие как техническая сложность сбора панкреатического сока у мышей, что делает TIF подходящим суррогатом.
