В Vivo CRISPR/Cas9 Скрининг для одновременной оценки функции гена в коже мыши и полости рта

Этот протокол имеет большое значение, поскольку он позволяет исследователям одновременно исследовать функции подавления опухолей сотен генов при раке головы и шеи за небольшую часть стоимости обычной модели мыши с нокаутом. Эта методика является гибкой и может быть адаптирована для покрытия экспрессии генов для изучения их функции в коже. Протокол таргетированной библиотеки CRISPR также может быть применен для других типов рака.

Поместите животное под наркозом брюшной стороной вверх на нагретый хирургический столик и с помощью хирургической ленты удерживайте лапы на месте. Установите зонд для анестезии носового конуса для постоянной подачи изофлурана и кислорода до завершения операции. Чтобы подтвердить беременность E9.5, нанесите небольшое количество крема для удаления волос на живот и распределите его по площади три на три квадратных сантиметра с помощью аппликатора с ватным наконечником.

Через две-три минуты аккуратно удалите крем марлей или салфеткой и протрите область с помощью PBS и 70% этанола. С помощью ультразвукового зонда и геля проверьте беременную мышь на эмбриональный день Е9.5. Это также можно сделать накануне в E8.5, чтобы сэкономить время в день операции.

Удалите гель для ультразвука и протрите область с помощью BPS, а затем 70% этанола. Больше всего вводите подкожный анальгетик. Затем вы стерильно щипцами и ножницами делаете вертикальный разрез на коже.

С помощью тупых щипцов отделите кожу вокруг разреза от брюшины. Затем вы стерильно щипцами и ножницами прорежете брюшину. С помощью тупых щипцов аккуратно вытащите левый и правый рог матки и подсчитайте эмбрионы.

Снова вставьте большую часть маточных рогов, но оставьте открытым дистальный конец одного маточного рога, содержащего три эмбриона. С помощью тупых щипцов осторожно протолкните и потяните матку с тремя эмбрионами, через отверстие в силиконовой мембране модифицированной чашки Петри. Стабилизируйте чашку Петри с помощью кубиков пластилина.

Стабилизируйте матку с тремя эмбрионами внутри чашки Петри, используя силиконовую форму. Затем расплющите силиконовую пробку сбоку от эмбрионов с помощью тупого инструмента. Заполните чашку Петри стерильным PBS и промойте силиконовую мембрану на дне чашки Петри, с животом беременной матери, тем самым предотвратив любое протекание.

Переместите ультразвуковую головку в чашку Петри, примерно на 0,5 сантиметра выше верхнего эмбриона, и отрегулируйте ступень так, чтобы амниотическая полость стала хорошо видна на УЗИ. Выровняйте иглу инжектора, осторожно в модифицированную чашку Петри. С помощью микроманипулятора поместите кончик иглы в пределах пяти миллиметров от верхнего эмбриона, затем перемещайте иглу вперед и назад, чтобы переместиться в плоскость, где ее кончик выглядит наиболее ярким на ультразвуковом изображении.

С помощью микроманипулятора протолкните иглу через стенку матки в околоплодные воды. Введите 62 нанолитра лентивируса с библиотекой sgRNA с медленной скоростью инъекции. Нажмите кнопку «Инъекция» восемь раз, в общей сложности 496 нанолитров на эмбрион.

Повторите ту же процедуру для двух других эмбрионов. Затем поднимите ультразвуковую головку и снимите силиконовую пробку. Аккуратно протолкните первые два из трех эмбрионов в брюшную полость мыши с помощью стерильного ватного тампона.

Вытащите следующие три эмбриона и вставьте ранее введенный третий эмбрион. Повторяйте процедуру инъекции до тех пор, пока не будет введено желаемое количество эмбрионов, следя за тем, чтобы анестезия не превышала 30 минут. Когда закончите, поднимите ультразвуковую головку, извлеките микроманипулятор с иглой, аспирируйте PBS и удалите чашку Петри.

Используя стерильные салфетки, впитайте любой PBS, который мог скопиться в брюшной полости. Закройте разрез брюшины с помощью рассасывающихся швов. Затем используйте две скобы, чтобы закрыть разрез на коже живота.

Далее, чтения секвенирования ПЦР-амплифицированной ДНК из плазмидных и лентивирусных трансдуцированных клеток должны показать высокую корреляцию. Если считывание sgRNA с плазмидной ДНК не показывает равного представительства sgРНК, то процедуру подготовки и концентрации вируса следует повторять с осторожностью. Здесь представлены результаты инъекции лентивируса, несущей Cre-рекомбиназу под ультразвуковым контролем, у детенышей мышей конфетти E9.5 Lox-STOP-Lox в постнатальный день P0.

В то время как высокий титр вируса приведет к большему покрытию кожи мыши, он также приведет к трансдукции нескольких sgRNA в одну и ту же клетку. На этом графике показаны чтения секвенирования нового поколения ДНК, амплифицированной с помощью ПЦР, из плазмидных и лентивирусных трансдуцированных клеток, а также чтения из четырех репрезентативных опухолей. Проводники sgРНК, нацеленные на супрессоры опухолей ADAM10 и RIPK4, обогащены образцами опухолей по сравнению с пулом плазмид или инфицированными клетками.

Проведение операции при E9.5 имеет решающее значение. Не забудьте проверить беременность с помощью ультразвука через девять дней после установки креста и определить временную точку эмбриона у каждой самки мыши. После рождения детенышей трансдуцированные клетки могут быть изолированы и тщательно профилированы с использованием новейших методов профилирования генов, таких как секвенирование РНК одиночных клеток.