Сочетание мультиплексной флуоресцентной гибридизации in situ с флуоресцентной иммуногистохимией на свежезамороженных или фиксированных срезах мозга мышей
25 июня 2021 г.
В этом протоколе описывается метод сочетания флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и флуоресцентной иммуногистохимии (IHC) как в свежезамороженных, так и в фиксированных срезах мозга мышей с целью получения мультиметочного FISH и флуоресцентного сигнала IHC. ИГХ нацелен на цитоплазматические и мембранные присоединенные белки.
Этот протокол сочетает в себе флуоресцентную РНК-гибридизацию in situ и иммуногистохимию с использованием свежезамороженных или фиксированных препаратов мозга. Этот метод обеспечивает гибкость, демонстрируя комбинацию высокочувствительных методов гибридизации in situ и иммуногистохимии для пространственной визуализации РНК и белковых мишеней в одном и том же образце ткани. Этот метод применим для мультиплексного мечения в срезе тканей мозга, помогая исследовать пространственную организацию и функциональную значимость мРНК и белков в гетерогенных популяциях нейронов в нейронауке.
Этот протокол в основном фокусируется на этапах обработки свежезамороженных тканей и фиксированных тканей с параформальдегидом. Чтобы начать секционирование свежезамороженной ткани мозга, прикрепите ее к предварительно охлажденному патрону криостата и вырежьте корональные срезы толщиной 14 микрометров. Установите срез на предметное стекло для микроскопии.
Переместите смонтированный слайд в коробку для скольжения. Затем транспортируйте коробку в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию на сухом льду. Для фиксации тканей процеживают приготовленный раствор параформальдегида.
Остудите его до 4 градусов по Цельсию. Вытащите смонтированное предметное стекло из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов по Цельсию на сухом льду и сразу же погрузите его в предварительно охлажденный раствор параформальдегида на 15 минут, Выполните обезвоживание свежезамороженной ткани, чтобы убедиться, что предметное стекло полностью высохло. После извлечения головного мозга из транскардиально профузионной фиксированной монтировки с помощью вибрирующего микротома вырезают срезы тканей толщиной 30 микрометров.
Срезанные срезы хранить в растворе криопротектора. В день проведения анализа FISH переложите свободно плавающую секцию в 12-луночную планшет для культивирования клеток, содержащую 0,1 молярного PBS, и перемешайте его при 90-100 об/мин на вращающемся платформенном шейкере, чтобы смыть криопротектор. Затем с помощью кисти установите срез плашмя на предметное стекло для микроскопии, чтобы предотвратить отслоение во время стирки, и сушите на воздухе не менее двух часов.
С помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте гидрофобный барьер вокруг участка, в котором будут содержаться реагенты FISH. После предварительной обработки ткань инкубируют в растворе протеазы и гибридизируют с зондами RNAscope в течение двух часов в соответствии с рекомендациями производителя. Затем проводят последовательные этапы амплификации и флуоресцентную иммуногистохимию.
Начните с подготовки увлажненной светозащищенной камеры для инкубации предметных стекол. На водяной бане прогрейте 50-кратный промывочный буфер и зонды до 40 градусов Цельсия в течение 10 минут. После охлаждения до комнатной температуры приготовьте один литр буфера для промывки 1X из концентрации бульона 50X.
Приготовьте зондовую смесь, как описано в текстовой рукописи. Для лечения протеиназой добавьте протеиназу 3 на срез ткани и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 30 минут. Чтобы смыть протеиназу, осторожно погрузите предметное стекло в 0,1 молярного PBS при комнатной температуре, избегая смещения секции.
Для гибридизации добавьте зондовую смесь на срез ткани. Поместите его в увлажненную предварительно прогретую камеру. Затем выдержите его в течение двух часов при температуре 40 градусов по Цельсию.
Промойте срез ткани буфером для стирки дважды в течение двух минут. Для усиления сигнала, используя флакон-капельницу, добавьте раствор для усиления, чтобы покрыть участок ткани, и инкубируйте, как описано в тексте. Добавьте блокирующий раствор на срез ткани и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание.
Проведите пальцем по слайду, чтобы удалить лишний блокирующий буфер после инкубации. Теперь инкубируйте срез с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 градуса по Цельсию. На следующий день промойте предметное стекло три раза 1X TBS.
Добавьте вторичное антитело и инкубируйте срезы в течение двух часов при комнатной температуре. Исследуйте предметное стекло под эпифлуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой. Получение репрезентативных изображений с 20-кратным увеличением и сохранение их в виде файлов TIF.
В настоящем исследовании качество, целостность тканей и отсутствие бактериальной контаминации были подтверждены отсутствием маркировки DAPI. Маркировка с помощью положительных контрольных зондов, нацеленных на убиквитин С, пептидилпролилизомеразу В и мРНК полимеразы IIA, подтвердила целостность РНК. В свежезамороженных препаратах для дифференциации мРНК-позитивных нейронов GalR1 в пределах NTS использовали дополнительные нейрохимические маркеры.
Мембраносвязанный везикулярный транспортер был четко промаркирован. Напротив, цитоплазматические белки, такие как тирозингидроксилаза и GFP, экспрессируемые под контролем промотора PHOX2B, слабо наблюдались и описывались как флокулянты, поскольку у них не было четких очертаний. Маркировка цитоплазматической мРНК GalR1 зондом GalR1 зондом GalR1 была точечной и четко наблюдаемой.
Для подтверждения того, что качество иммуногистохимии зависит от субклеточной локализации белка, в одних и тех же срезах ткани параллельно с FISH были мечены различные ядерные и цитоплазматические белки. Цитоплазматический PHOX2B GFP имел хлопьевидный вид. В то время как сигнал ядерного белка PHOX2B был четким, что подтверждало более высокое качество иммуномечения в сочетании с FISH.
При проведении на фиксированных замороженных срезах в комбинации с FISH иммуногистохимия была достоверной независимо от субклеточной локализации. МРНК-позитивные нейроны GlyT2 располагались вентрально по отношению к NTS, а не внутри NTS. МРНК-позитивные нейроны GlyT2 и мРНК-позитивные PHOX2B не локализуются.
Субпопуляция мРНК-позитивных NTS-нейронов PHOX2B была иммунореактивной к тирозингидроксилазе, и ни одна из них не содержала мРНК GlyT2. РНК-скоп позволяет визуализировать и анализировать распределение РНК с разрешением одной молекулы в клетках и тканях. Это позволяет проводить исследования новых видов РНК, механизмов заболеваний, паттернов экспрессии генов, разнообразия нейронов и клеточных взаимодействий.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол совмещения флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) и флуоресцентной иммуногистохимии (ИГХ) на свежезамороженных и фиксированных срезах мозга мыши. Данный метод позволяет одновременно осуществлять пространственную визуализацию мишеней РНК и белков, что способствует исследованию популяций нейронов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Молекулярная биология
- Иммуногистохимия
Теоретические основы
- В данном исследовании изучается пространственная организация мРНК и белков в гетерогенных популяциях нейронов.
- Сочетание методов FISH и ИГХ позволяет осуществлять мультиплексное мечение в срезах тканей головного мозга.
- Цель работы заключается в более глубоком понимании экспрессии генов и локализации белков в мозге.
- Данный протокол применим как к свежезамороженным, так и к фиксированным параформальдегидом тканям.
Цель исследования
- Продемонстрировать надежный и гибкий метод одновременного детектирования РНК и белков.
- Улучшить изучение распределения мРНК и локализации белков в нейрональных клетках.
- Подтвердить качество иммуногистохимического мечения при сочетании с методом FISH.
Используемые методы
- В качестве основной платформы использовались свежезамороженные и фиксированные параформальдегидом срезы мозга.
- Биологическая модель включала ткань мозга мыши с акцентом на РНК- и белковые сигналы в нейронах.
- Метод включает такие критические этапы, как секционирование, фиксация, гибридизация и усиление сигнала.
- Для обеспечения четких результатов строго соблюдались детальные протоколы инкубации и промывки.
Основные результаты
- Зонды положительного контроля подтвердили целостность РНК, в то время как четкость сигнала для белков варьировалась в разной степени.
- Исследование продемонстрировало возможность дифференциации цитоплазматических и ядерных сигналов в нейронах.
- Были отмечены признаки наличия отдельных популяций нейронов и особенностей экспрессии РНК/белков в них.
- Комбинация методов FISH и ИГХ оказалась надежной для визуализации нескольких мишеней на одних и тех же срезах.
Выводы
- Данный протокол позволяет проводить углубленное исследование разнообразия нейронов и их взаимодействия в тканях головного мозга.
- Настоящее исследование создает основу для дальнейшего изучения нейронных механизмов и разработки потенциальных моделей заболеваний.
- Этот метод расширяет наше понимание молекулярной и клеточной динамики в нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Сочетание мультиплексного FISH с флуоресцентным IHC позволяет специалистам по биофармацевтическим исследованиям и разработкам определять пространственную коэкспрессию РНК- и белковых мишеней в гетерогенных популяциях нейронов, что способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков при поиске новых лекарственных препаратов в области нейронаук. Данный подход повышает прогностическую достоверность за счет связывания молекулярных сигнатур с клеточными фенотипами, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки на ранних этапах поиска. Применимость метода к свежезамороженным и фиксированным тканям обеспечивает гибкость рабочего процесса при анализе мишеней в доклинических моделях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем картирования малопредставленных мРНК (например, рецептора галанина 1) и высокопредставленных транскриптов внутри ядер мозга, определенных с помощью иммуногистохимического анализа.
- Практическая ценность: Способствует снижению биологических рисков за счет одновременного маркирования РНК и белков, что позволяет уточнить взаимодействие с мишенью и модуляцию путей в нейронных цепях.
- Прогностическая ценность: Облегчает приоритизацию портфеля исследований путем разграничения нейронных субпопуляций на основе нейрохимических сигнатур, что снижает неопределенность при выборе мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга путем подтверждения целостности RNA с помощью зондов положительного контроля (ubiquitin C, peptidylprolyl isomerase B, RNA polymerase IIA).
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации анализа за счет оптимизации условий инкубации с протеазой и гибридизации, что повышает воспроизводимость результатов при работе с образцами свежезамороженных и фиксированных тканей.
- Ценность масштабируемости: Возможность повторного использования платформы для мультиплексного детектирования RNA-белков, что способствует надежной оценке соединений в кампаниях по фенотипическому скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Улучшает согласованность трансляционных биомаркеров за счет визуализации пространственной организации экспрессии мРНК и белков в релевантных для заболевания ядрах ствола мозга (например, NTS).
- Операционная ценность: Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет сохранения качества ИГХ после проведения FISH, особенно для мембранных мишеней.
- Прогресс с учетом рисков: Помогает в принятии решений, выявляя отсутствие колокализации между GlyT2 мРНК-положительными и PHOX2B мРНК-положительными нейронами, что позволяет уточнить механистические модели.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий цикл разработки — от идентификации мишени до оптимизации ведущего соединения, обеспечивая пространственную валидацию молекулярных мишеней в популяциях нейронов перед проведением фенотипического скрининга.
- Биологические открытия: Оказывает поддержку в проверке гипотез и уточнении путей передачи сигналов путем определения распределения РНК в нейронах, идентифицированных с помощью иммуногистохимии, что снижает неопределенность механизмов.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных рабочих процессов FISH-IHC, гарантируя воспроизводимые пространственные результаты для оценки ответа на соединение.
- Аналитика: Генерирует количественные пространственные данные посредством детектирования флуоресцентного сигнала, позволяя сравнивать уровни экспрессии РНК и белков в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями путем валидации экспрессии мишени в препаратах фиксированных тканей, поддерживая моделирование заболеваний с привязкой к биомаркерам.
- Корпоративное повторное использование: Служит в качестве многократно используемого метода пространственного профилирования в рамках программ по нейробиологическим исследованиям, максимально эффективно используя инвестиции в инфраструктуру.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов за счет прямой визуализации коэкспрессии РНК и белков, что снижает количество ложноположительных результатов при валидации мишеней.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию и воспроизводимость благодаря оптимизированным этапам обработки протеазой и гибридизации, минимизируя вариативность при мультиплексном мечении.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах снижать риски, связанные с мишенями, благодаря субклеточному разрешению, что уменьшает вероятность неудач на поздних стадиях из-за биологического несоответствия.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков путем идентификации нейрональных субпопуляций с различными профилями РНК и белков, что помогает в выборе показаний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с флуоресцентной микроскопией, зондами на РНК и оптимизацией антител для контроля специфичности сигнала.
- Зависит от наличия условий, исключающих воздействие РНказ, инструментов для срезания тканей (криостата или микротома), а также систем флуоресцентной визуализации с соответствующими наборами фильтров.
- Необходимо межкомандное согласование времени инкубации с протеазами и протоколов валидации антител для обеспечения стабильного качества ИГХ после проведения FISH.
- Требуется адаптация метода в зависимости от субклеточной локализации белков, так как для цитоплазматических мишеней может потребоваться длительный подбор условий, в то время как для мембранных белков специфичность обычно сохраняется.
- Ограничено сложностями обработки тканей в фиксированных замороженных препаратах, хотя качество ИГХ повышается при оптимизации с использованием RNAscope.
