Одновременное живое изображение нескольких эмбрионов насекомых в образец камерного листа флуоресценции микроскопов

Светолистовые флуоресцентные микроскопы на основе камеры образца предназначены для работы с высоким содержанием, а не с высокой пропускной способностью. Таким образом, визуализационные анализы в реальном времени должны выполняться последовательно и, таким образом, в меньшей степени подвержены влиянию изменений окружающей среды. Наш держатель паутины позволяет складывать и одновременно визуализировать несколько эмбрионов, устраняя колебания окружающей среды и увеличивая производительность.

Крепление эмбрионов в держатель паутины требует определенной утонченности. Поясняющее видео идеально подходит для иллюстрации последовательности множества коротких жестов. Для калибровки образца в камере на основе светового листа флуоресцентного микроскопа.

Во-первых, повторно разжигите аликвоту агарозы в смесителе с сухим блоком нагревателей при температуре 80 градусов Цельсия. Дайте расплавленной агарозе остыть до 35 градусов по Цельсию и перелейте 50 микролитров агарозы в реакционную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Смешайте 0,5 микролитра раствора флуоресцентной микросферы с агарозой со скоростью 1 400 оборотов в минуту в течение одной минуты и заполните щелевое отверстие держателя паутины 10 микролитрами смеси раствора агарозной флуоресцентной микросферы.

Аспирируйте как можно больше агарозы до тех пор, пока не останется только тонкая пленка агарозы, и дайте агарозе застыть в течение 30-60 секунд. Наполните камеру для образцов автоклавной водой из-под крана и медленно вставьте держатель паутины в камеру для образцов. Переместите отверстие с прорезью перед линзой обнаружения и поверните держатель в положение 45 градусов относительно осей освещения и обнаружения.

Держатель паутины не должен быть виден в канале передающего света. Переключитесь на соответствующий флуоресцентный канал и отрегулируйте мощность лазера и время экспозиции, чтобы флуоресцентные микросферы подавали надлежащий сигнал. Укажите объем обзора, который полностью покрывает теперь поперечно ориентированную агарозную пленку, и рассчитайте максимально возможное осевое разрешение для соответствующей комбинации линз освещения и обнаружения, чтобы определить расстояние Z.

Затем запишите трехмерный тестовый стек Z флуоресцентных микросфер и сравните проекции максимумов X, Y и Z с калибровочной таблицей. Если микросферы выглядят размытыми, нечеткими или искаженными. Отрегулируйте положение линз подсветки и/или обнаружения.

Для дехорионации эмбриона добавьте восемь миллилитров автоклавной водопроводной воды в лунки А1, А2, А3 и В3 одно-шестилуночной пластины на линию. Затем добавьте семь миллилитров автоклавной водопроводной воды и один миллилитр раствора гипохлорита натрия в лунки В1 и В2. Поместите первую пластину под стереомикроскоп и вставьте первый эмбрион, содержащий клеточный фильтр, в лунку А1.

Промойте эмбрионы при слабом перемешивании в течение 30-60 секунд, прежде чем переместить ситечко в колодец B1. Энергично встряхивайте пластину в течение 30 секунд, прежде чем перенести сетчатое фильтр в лунку A2. Промойте эмбрионы в течение одной минуты при легком помешивании и переместите ситечко в лунку B2 для энергичного встряхивания до тех пор, пока большинство эмбрионов полностью не дехорионируются.

Затем перенесите ситечко в лунку А3 на одну минуту для бережной промывки, прежде чем хранить ситечко дехорионированных эмбрионов в лунке В3 до тех пор, пока эмбрионы других линий не будут обработаны так, как показано на рисунке. Чтобы установить эмбрионы на держатель для паутины, повторно добавьте аликвоту агарозы, как показано на рисунке. Когда агароза остынет, поместите держатель паутины под стереомикроскоп и добавьте 10 микролитров агарозы на щелевое отверстие.

Используйте наконечник пипетки, чтобы распределить агарозу по щелевым отверстиям, прежде чем аспирировать как можно больше агарозы, пока не останется только тонкая агарозная пленка. Когда агароза застынет, с помощью кисти осторожно соберите и перенесите эмбрионы на агарозную пленку. Расположите их вдоль длинной оси отверстия с прорезями так, чтобы их передне-задние оси были выровнены с длинной осью отверстия с прорезями.

Чтобы стабилизировать зародыши, осторожно внесите пипеткой один-два микролитра агарозы в промежуток между эмбрионами и агарозной пленкой. Когда агароза застынет, медленно вставьте держатель паутины с установленными эмбрионами в камеру для образца, заполненную буфером изображения. Чтобы получить изображение эмбрионов, убедитесь, что держатель паутины находится в положении под углом 45 градусов относительно осей освещения и обнаружения, а в канале пропускающего света переместите эмбрион в центр поля зрения.

Держатель паутины не должен быть виден. Затем перемещайте эмбрион со стадией микротрансляции в точке Z до тех пор, пока средняя плоскость эмбриона не пересечется с фокальной плоскостью, а контур не станет четким. Не переключаясь на флуоресцентный канал, переместите эмбрион на 250 мкм в обе стороны, чтобы задать объем обзора.

Если требуется визуализация в нескольких направлениях, поверните эмбрион соответствующим образом, сфокусируйте эмбрион и укажите объем обзора, как показано выше. Затем повторите эту процедуру для всех остальных эмбрионов. После того, как объем обзора будет указан для всех эмбрионов, определите флуоресцентный канал и параметры интервальной съемки и начните процесс визуализации.

Для анализов, которые длятся несколько дней, рассмотрите возможность закрытия отверстия камеры для образца хотя бы частично, чтобы уменьшить испарение. Когда визуализирующий анализ закончится, осторожно снимите держатель паутины с камеры для образцов и с помощью небольшой кисти отделите эмбрионы от агарозной пленки и поместите эмбрионы на предметное стекло микроскопа с соответствующей маркировкой. Поместите предметное стекло в приемную чашку для инкубации в соответствующих стандартных условиях выращивания.

По мере приближения момента вылупления регулярно проверяйте приемные чашки и переносите вылупившихся личинок в отдельные лунки 24-луночной пластины. Заполните лунки наполовину подходящей питательной средой, затем инкубируйте личинки в соответствующих стандартных условиях выращивания. Когда наблюдаемые особи достигнут взрослого возраста, обеспечьте подходящих партнеров для спаривания и проверьте наличие потомства через несколько дней.

В этом видео можно наблюдать динамику флуоресцентного сигнала трех эмбрионов, полученных из разных трансгенных линий дрозофилы в течение примерно одного дня. Аналогичная картина флуоресценции была ожидаемой, поскольку все линии экспрессировали локализованный в ядре EGFP под контролем предположительно вездесущих и составляюще активных промоторов. Однако сравнительные результаты визуализации в реальном времени выявили сильные пространственно-временные различия в паттернах экспрессии, которые не были вторичными эффектами из-за дисперсии окружающей среды.

В этом анализе три эмбриона Tribolium, несущих один и тот же трансген на основе piggyback. Сравнительные результаты визуализации процесса закрытия окна серозы во время гаструляции в реальном времени показывают, что вторая подлиния обеспечивает значительно более сильный общий сигнал, чем две другие подлинии. Как показывают эти данные, геномный контекст также может оказывать сильное влияние на уровень экспрессии трансгенов в Tribolium.

Наш подход хорошо подходит для анализа фенотипов нокдауна и нокаута, поскольку он позволяет одновременно визуализировать эмбрионы с контролем дикого типа. Наш протокол также может быть использован для сравнения морфогенеза двух или более видов насекомых. И, таким образом, получить более глубокое понимание эволюции развития.