Измерение 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках с использованием 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он предоставляет метод измерения и визуализации сигналов FRET или циклического AMP в трех пространственных измерениях в отдельных ячейках. Циклические распределения АМФ могут происходить не только в осевом, но и в поперечном направлении, и для выборки этих распределений важно получать данные изображений циклического АМФ FRET в трех измерениях. В день визуализации теплый Тайрод буферизует до 37 градусов Цельсия на водяной бане и устанавливает покровную пластину, сидящую с трансфицированными клетками, представляющими интерес, в камеру для клеток.

Закрепите верхнюю часть камеры монтажной прокладкой, чтобы предотвратить утечку, и используйте деликатный стеклоочиститель для удаления лишней среды или прилипших элементов с нижней части защитного стекла. Добавьте 800 микролитров рабочего буфера и четыре микролитра пятимиллимолярной ядерной метки в камеру клетки и осторожно покачивайте камеру в течение пяти-10 секунд. Затем накройте камеру клетки алюминиевой фольгой на 10 минут инкубации при комнатной температуре.

Чтобы получить изображение клеток, выберите 60-кратный объектив для погружения в воду на конфокальном микроскопе, оснащенном спектральным детектором, и добавьте каплю воды в объектив. Поместите загруженную камеру ячейки на предметный столик микроскопа и настройте ручку фильтра для выбора подходящего набора фильтров. Выберите режим флуоресцентного широкоугольного обзора и с помощью окуляров выберите поле зрения, содержащее ячейки, экспрессирующие датчик циклического усилителя FRET.

Откройте программное обеспечение для обработки изображений, выберите конфокальный режим и разблокируйте кнопку блокировки лазера. Откройте меню настроек А1. Отметьте флажками, соответствующими лазерным линиям 405 и 561 нанометров, и установите эти спектральные обнаружения на SD, разрешение на 10, а каналы на 32.

Выберите начальное и конечное значения длины волны, чтобы задать диапазон длин волн. Откройте меню «Настройки» A1, чтобы выбрать значок пропуска группирования. Выберите поле под номером 15 и нажмите OK. Установите интенсивность лазера равной восьми процентам для 405-нанометрового лазера и двум процентам для 561-нанометрового лазера.

Установите усиление детектора на 149 и радиус точечного отверстия на 2,4 единицы диска Эйри. Установите скорость сканирования равной 25 спектральным кадрам в секунду и выберите однонаправленное направление сканирования. Установите число на четыре, а размер сканирования на 1024 на 1024.

Чтобы определить параметры сбора данных z-стека, нажмите «Вид», «Управление захватом» и «Захват ND», а затем введите назначение и имя файла во всплывающем окне, чтобы сохранить файл ND. Щелкните поле z-серии и нажмите «Трансляция» в окне настроек A1 Plus, чтобы открыть окно просмотра в реальном времени. Отрегулируйте ручку фокусировки, чтобы сфокусироваться на ячейках во время просмотра в окне предварительного просмотра.

Отрегулируйте ручку фокусировки на микроскопе, чтобы выбрать верхнюю часть ячейки, и нажмите «Верх» в окне «Захват ND», чтобы установить текущее положение в качестве верха. Отрегулируйте ручку фокусировки на микроскопе, чтобы выбрать нижнюю часть ячейки, и нажмите «Нижняя часть», чтобы установить текущее положение в качестве нижней. Введите один микрометр для размера шага.

Выберите Top Bottom для направления z-сканирования и нажмите кнопку run, чтобы получить z-стек. Когда получение z-стека будет завершено, с помощью пипетки аккуратно добавьте интересующий реагент в камеру, не повреждая клетки. Через 10 минут измените имя файла и получите второе изображение z-стека.

После создания изображений создайте новые папки с теми же именами файлов, что и спектральные z-стековые изображения, и откройте интересующий вас файл спектрального изображения. Нажмите «Файл», «Импорт/экспорт» и «Экспорт документа ND». Во всплывающем окне выберите только что созданную папку, TIFF для типа файла, моноизображение для каждого канала и сохраните битовую глубину.

Нажмите кнопку «Экспорт», чтобы экспортировать отдельные файлы в папку, и откройте программу линейного спектрального расмешивания. Откройте опцию Линейное разъединение. m и нажмите кнопку Выполнить.

Найдите и выберите папку, содержащую экспортированную последовательность файлов TIFF, и нажмите OK, чтобы открыть окно длины волны и z-среза. Скопируйте имя первого файла без z-среза и номера канала из папки и вставьте его на первом шаге поля Ввод имени изображения, введите количество каналов в поле Введите количество полос длины волны и количество z-срезов в поле Введите количество Z-срезов и нажмите OK. Затем во всплывающем окне найдите и выберите длину волны. mat и нажмите кнопку Открыть.

Найдите и выберите файл Library. mat в новом всплывающем окне и нажмите «Открыть» еще раз, чтобы начать восстановление фрагмента. Чтобы рассчитать эффективность FRET, откройте multiFRRCF.

m и введите количество экспериментальных испытаний для анализа в поле Сколько папок для повторного использования. Нажмите OK. Выберите несмешанные папки и нажмите OK еще раз. В новом всплывающем окне установите коэффициент масштабирования на 12,4, порог на 56, частоты X, Y и Z на пять, пять и один соответственно, а алгоритм сглаживания на гауссов

Затем нажмите Run (Выполнить), чтобы выполнить измерения FRET и ресклейринг. Чтобы сопоставить эффективность FRET с циклическими уровнями АМФ, откройте Mapping_FRET. Efficiency_to_cAMP_concentration. m и нажмите кнопку Выполнить.

Перейдите к первому изображению FRET в оттенках серого, выберите его и нажмите OK. Затем откройте изображения циклического усилителя FRET, чтобы проверить распределение сигналов циклического усилителя в трех измерениях. На этих изображениях можно наблюдать трехмерные изображения ложных цветных необработанных гиперспектральных изображений, полученных с помощью конфокальной микроскопии на исходном уровне и через 10 минут после лечения форсколином. В этом анализе акцепторный флуорофор был полностью фоторазрушен, что позволило получить спектральные сигнатуры донора и акцептора с помощью стехиометрии один к одному.

Нетрансфицированные клетки, помеченные ядерным красителем, использовали для получения чистого спектра флуорофора красителя. Объединение спектров донора, акцептора и флуорофоров ядерного красителя позволяет создать трехкомпонентную библиотеку. Здесь можно наблюдать источники трех фоновых спектральных сигнатур.

Несмотря на то, что эти сигналы распределены неравномерно в пределах выборки и не могут быть просто вычтены из него, добавление спектральных сигнатур этих сигналов в спектральную библиотеку и использование линейного несмешивания для разделения сигналов обеспечивает подход к удалению этих искажающих сигналов из сигналов-донора и акцептора перед вычислением их эффективности FRET. Затем шестикомпонентная спектральная библиотека может быть использована для выполнения линейного спектрального расмешивания для каждого среза в осевом изображении. Здесь можно наблюдать изменения эффективности FRET и циклических уровней АМФ в различных срезах плоскости XY, что позволяет сравнивать исходные условия и условия через 10 минут после обработки форсколином.

Этот метод также может быть использован для количественной оценки эффективности FRET других репортеров в трех измерениях как в клетках, так и в тканях.