Атомно-силовая микроскопия в сочетании с инфракрасной спектроскопией в качестве инструмента для исследования химии одиночных бактерий
15 сентября 2020 г.
Атомно-силовая микроскопия-инфракрасная спектроскопия (AFM-IR) обеспечивает мощную платформу для бактериальных исследований, позволяющую достичь наноразмерного разрешения. Как картирование субклеточных изменений (например, при делении клеток), так и сравнительные исследования химического состава (например, возникающие из лекарственной устойчивости) могут проводиться на уровне одной клетки у бактерий.
Метод позволяет проводить наномасштабные исследования бактерий. Он дает нам подробное представление о химических изменениях в устойчивости к противомикробным препаратам. Таким образом, это может способствовать нашему пониманию УПП и разработки лекарств.
Наноразмерные размеры бактерий существенно ограничивают доступные исследовательские инструменты, способные исследовать их химию. АСМ-ИК позволяет нам делать это неразрушающим, независимым от наблюдателя способом, даже на субклеточном уровне. Давая представление об устойчивости к противомикробным препаратам, этот метод может помочь идентифицировать и протестировать молекулярные мишени для новых противомикробных препаратов.
Помимо бактерий, АСМ-ИК может исследовать целый ряд клеток, тканей и даже вирусов. Чтобы подготовить образец для АСМ-ИК-визуализации, после выращивания интересующих бактерий в соответствующей среде в соответствующих условиях культивирования, используйте стерильную петлю для тщательного отбора бактерий с верхушки колоний для переноса в стеклянную пробирку. Добавьте в пробирку один миллилитр сверхчистой воды и делайте вихрь в течение одной-двух минут, пока собранная бактериальная гранула не перестанет быть видна на дне пробирки.
Оцените грубую мутность раствора путем визуального сравнения приготовленного раствора со стандартами Макфарланда. Если мутность бактериальной суспензии оказывается очень низкой, продолжайте добавлять больше бактерий и в вихрь до тех пор, пока грубая мутность раствора не станет сопоставимой со стандартами 0,5 и 1 Макфарланда. Гранулируйте бактерии центрифугированием и осторожно отсасывайте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
Суспендируйте бактериальную клеточную гранулу в одном миллилитре сверхчистой воды с помощью вортексирования, а осадите бактерии с помощью другого центрифугирования. После промывки бактерий еще до трех раз, как только что было показано, аспирируйте надосадочную жидкость и делайте гранулу вихревой жидкостью в течение как минимум двух минут, прежде чем добавить пять микролитров клеток на экспериментальный субстрат. Если желаемая толщина представляет собой монослой или отдельные бактерии, сразу после нанесения добавьте в субстрат от 20 до 100 микролитров сверхчистой воды и аккуратно перемешайте раствор наконечником для пипетки.
Когда образец высохнет на воздухе, используйте двустороннюю клейкую ленту для крепления подложки на металлический диск для образцов АСМ. Чтобы подготовить прибор для АСМ-ИК-спектроскопии к анализу, нажмите кнопку Initialize после включения программного обеспечения и лазера и убедитесь, что затвор лазера находится в открытом положении. Во время этого процесса появится окно инициализации этапа.
Когда процесс инициализации будет завершен, нажмите кнопку Инициализировать и OK. Если возможно, включите поток азота, чтобы продуть прибор азотом, и отрегулируйте продувку азотом для достижения стабильного уровня влажности. Осторожно поместите образец в камеру для образцов, не повредив наконечник, и нажмите «Загрузить» в программном обеспечении. Следуйте указаниям мастера для загрузки образца, уделяя особое внимание наконечнику и образцу на каждом шаге.
Затем нажмите кнопку Подход, чтобы подойти к образцу, не вступая в контакт. Прежде чем использовать образец, выберите «Инструменты», «Калибровка ИК-фона» и «Новый». Во всплывающем окне установите разрешение и спектральный диапазон в соответствии с целью анализа, а также установите средние значения и фон на средние значения.
Выберите Включить. Во всплывающем окне задайте начальный и конечный параметры и нажмите «Принять» и «Получить». Когда фоновые данные будут получены, нажмите кнопку Сохранить.
Чтобы привязать кончик к образцу, нажмите кнопку Зацепить. Система будет приближаться к поверхности образца до тех пор, пока не будет обнаружен прямой контакт. Нажмите кнопку Сканировать (Scan) для получения исходного изображения АСМ большей площади с низким пространственным разрешением для визуализации поверхности перед перемещением зонда в интересующую точку измерения.
Чтобы выровнять инфракрасный лазер по волновому номеру, при котором образец будет поглощать, введите волновое число, при котором образец будет поглощать, в поле Волновое число и нажмите Пуск, IR.At на графике Амплитуда в зависимости от частоты должен наблюдаться хотя бы один четкий пик. График зависимости от времени должен показывать форму периодической волны. Нажмите кнопку Оптимизировать, чтобы выбрать обычный спектр инфракрасных бактерий для определения положения каналов и использовать спектр для оптимизации горячих точек при различных значениях волновых чисел из различных областей спектра.
После оптимизации инфракрасных пятен для выбранных значений волновых чисел определите спектральное разрешение, диапазон и количество соусредненных значений и нажмите кнопку Захватить, чтобы собрать спектр АСМ-ИК. Чтобы получить изображение распределения интенсивности для выбранного значения волнового числа, после записи одного спектра АСМ-ИК записать изображение АСМ выбранной области выборки и выбрать значения волнового числа для изображения АСМ-ИК. Убедитесь, что ИК-пятно лазера оптимизировано для выбранных значений волнового числа, и задайте количество точек данных в направлениях X и Y области изображения.
В окне «Общие» задайте мощность лазера. В окне Сканирование АСМ задайте скорость сканирования. Затем установите флажок «Включить ИК-визуализацию» и нажмите «Сканировать», чтобы начать визуализацию.
АСМ-ИК интенсивности сигнала на выбранном волновом числе будет собираться одновременно с данными АСМ из этой области. Этот протокол позволяет получать информацию о различных типах распределения клеток бактерий на субстрате, от одиночных клеток до монослоев и многослойных. Протокол может быть использован для мониторинга динамических изменений в живых бактериях.
Например, при формировании перегородки при делении клеток S.aureus. АСМ-ИК-спектр перегородки характеризовался более высокой относительной интенсивностью полос на 1,240 и 1,090 см по сравнению со спектрами АСМ-ИК, собранными из клеточной области, что позволяет предположить, что перегородка состоит из углеводных и фосфодиэфирных групп компонентов клеточной стенки. Протокол также может быть использован для изучения различий в химическом составе, возникающих в результате развития резистентности.
Как было отмечено в этом репрезентативном анализе, не было измерено никаких морфологических различий между прерывистой резистентностью к ванкомицину и чувствительными к ванкомицину клетками S.aureus. Однако оценка спектров АСМ-ИК и их вторых производных выявила явное увеличение относительной интенсивности полос, связанных с углеводной и фосфодиэфирной группами компонентов клеточной стенки у резистентного штамма по сравнению с восприимчивым аналогом. Важно подготовить чистый образец, поэтому позаботьтесь о том, чтобы уменьшить вклад среды с самого начала и полностью удалить ее после нескольких стирок.
Поскольку АСМ-ИК является неразрушающим методом, образец может быть позже изучен с помощью других методов, таких как окрашивание или конфокальная ионная спектроскопия, которые могут предоставить дополнительную информацию об их химическом составе.
Обзор
Атомно-силовая микроскопия в сочетании с ИК-спектроскопией (AFM-IR) позволяет проводить исследования бактерий на наноразмерном уровне, предоставляя данные о химических изменениях, связанных с антимикробной резистентностью. Этот метод обеспечивает неразрушающий анализ на субклеточном уровне, расширяя наше понимание механизмов лекарственной устойчивости.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Микробиология
- Биофизика
Теоретическая часть
- AFM-IR представляет собой мощную платформу для изучения бактерий.
- Наноразмерный масштаб бактерий ограничивает доступный инструментарий для исследований.
- Понимание механизмов антимикробной резистентности (AMR) имеет решающее значение для разработки лекарственных препаратов.
- AFM-IR позволяет анализировать различные биологические образцы, включая клетки и ткани.
Цель исследования
- Изучение химических изменений в бактериях, связанных с антимикробной резистентностью (AMR).
- Идентификация молекулярных мишеней для новых антимикробных препаратов.
- Мониторинг динамических изменений в живых бактериях.
Используемые методы
- Подготовка образцов включает выращивание бактерий и перемешивание на вортексе.
- Визуализация методом AFM-IR проводится после нанесения образца на подложку.
- Калибровка прибора и сбор фоновых данных являются обязательными этапами.
- Сбор данных включает получение AFM-изображений и инфракрасных спектров.
Основные результаты
- AFM-IR позволяет выявлять различия в химическом составе резистентных бактерий.
- В перегородке во время деления клеток наблюдались полосы более высокой интенсивности.
- Морфологических различий между резистентными и чувствительными штаммами отмечено не было.
- Спектры AFM-IR предоставили важные сведения о компонентах клеточной стенки бактерий.
Выводы
- AFM-IR является ценным инструментом для изучения химии бактерий.
- Этот метод расширяет понимание механизмов AMR.
- Он может способствовать разработке новых антимикробных стратегий.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
AFM-IR позволяет проводить химический анализ отдельных бактерий на наноуровне, что отвечает критической потребности в фенотипическом исследовании для изучения антимикробной резистентности. Обеспечивая одновременное получение пространственных и спектральных данных с субклеточным разрешением, этот метод способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов на ранних этапах поиска антибиотиков. Данная возможность повышает достоверность прогнозирования при идентификации молекулярных мишеней и мониторинге механизмов резистентности, что напрямую влияет на поиск перспективных соединений и принятие решений на доклиническом этапе.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая изменения химического состава с фенотипами антимикробной резистентности.
- Практическая ценность: Обеспечивает неразрушающее, независимое от оператора химическое профилирование на уровне отдельных клеток для функциональной валидации мишеней.
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность за счет прямого наблюдения за изменениями компонентов клеточной стенки в резистентных штаммах.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных бактериальных систем для последующих этапов анализа путем удаления компонентов среды с помощью стандартизированных протоколов промывки.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет контролируемого нанесения образцов и подготовки подложки для согласованного сбора данных AFM-IR.
- Научная ценность: Возможность надежной оценки соединений путем получения изображений распределения интенсивности на определенных волновых числах для картирования химических изменений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает актуальность исследования заболевания за счет изучения химического состава, возникающего в результате развития резистентности в клинически значимых штаммах, таких как S. aureus.
- Практическая ценность: Поддерживает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя проводить после AFM-IR анализ с помощью дополнительных методов, таких как окрашивание или конфокальная спектроскопия.
- Научная ценность: Облегчает принятие взвешенных решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, позволяя дифференцировать резистентные и чувствительные штаммы по спектральным биомаркерам, не полагаясь на морфологические различия.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
AFM-IR вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез на ранних этапах биологических исследований до идентификации перспективных соединений и доклинической валидации, обеспечивая итерационные циклы «дизайн-синтез-тест» при разработке антибиотиков.
- Открытия в биологии: Поддерживает проверку гипотез путем обнаружения химических изменений при формировании перегородки и в компонентах клеточной стенки во время деления бактерий и развития резистентности.
- Скрининг: Обеспечивает готовность к анализу за счет стандартизированного приготовления бактериальной суспензии с использованием стандартов мутности МакФарланда и последовательных этапов промывки.
- Аналитика: Позволяет получать количественные инфракрасные спектры и проводить анализ второй производной для сравнения резистентных и чувствительных штаммов на основе интенсивности полос при 1,240 и 1,090 cm⁻¹.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет возможности неразрушающего отбора проб для последующей валидации ортогональными методами.
- Корпоративное повторное использование: Служит универсальной платформой для анализа различных биологических образцов, включая клетки, ткани и вирусы, помимо исследований бактерий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической уверенности при идентификации мишеней, устранение неопределенности в понимании механизмов резистентности и снижение фенотипических рисков при разработке кандидатов в антибиотики.
- Операционная ценность: Стандартизация за счет подготовки образцов с использованием вортекса, воспроизводимость благодаря совместному усреднению калибровки фона и масштабируемость от картирования отдельных клеток до монослоев.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет прямого детектирования химических биомаркеров, эффективность использования капитала при раннем скрининге мишеней и снижение частоты неудач на поздних стадиях из-за непредвиденных механизмов резистентности.
- Влияние на портфель: Приоритизация ведущих соединений на основе анализа рисков путем идентификации биосинтеза клеточной стенки как пути, связанного с резистентностью, что позволяет продвигать разработку с учетом механизмов действия.
Особенности реализации
- Требуются знания в области микробиологии для стерильной работы с бактериями, а также опыт работы с оборудованием AFM-IR для юстировки лазера и оптимизации спектров.
- Необходим AFM-IR спектрометр с возможностью продувки азотом, системы ультрачистой воды и подложки, совместимые с адгезивным креплением.
- Требуется стандартизация протоколов промывки образцов между исследовательскими группами для минимизации влияния среды и обеспечения точности спектров.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных видов бактерий, фаз роста и типов подложек для поддержания соотношения сигнал/шум.
- Метод ограничен необходимостью использования спектральных библиотек-эталонов для отнесения пиков к конкретным биомолекулам, а также временными затратами на поточечное картирование по сравнению с объемным ИК-анализом.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Atomic Force Microscopy-Infrared (AFM-IR) Spectroscopy Sample Preparation
2:50
Instrument Preparation
3:50
Single Spectrum Data Collection
5:42
Imaging Approach Data Collection
6:41
Results: Representative AFM-IR Analyses of Single Bacterium Chemistry
8:11
Conclusion
