Криогенная загрузка образца в вращающийся ядерный магнитно-резонансный спектрометр под магическим углом, который сохраняет жизнеспособность клеток

Чувствительность ЯМР-спектроскопии MAS с помощью ДНФ позволяет охарактеризовать белки внутри интактных клеток в их эндогенной концентрации. Это применение требует тщательного обращения с образцом. Некоторые морфологии сохраняются, и клетки становятся жизнеспособными при их криогенном переносе в спектрометр с использованием этого протокола.

Введение холодного ротора может привести к образованию влаги и льда, что может механически препятствовать раскрутке образца. Эта демонстрация поможет провести эксперименты для уверенного выполнения криогенного переноса. Для начала положите под крышку и на дно криогенного флакона подушку, сделанную из кусочка салфетки или бумажного полотенца.

Поместите 3,2-миллиметровый сапфировый ротор в криогенный флакон, обитый папиросной бумагой, маркированным концом к дну флакона. Медленно заморозьте ротор, поместив флакон в контейнер с контролируемой скоростью охлаждения, и поместите контейнер в морозильную камеру с температурой 80 градусов Цельсия минимум на три часа. Переложите криогенный флакон с замороженным ротором в небольшую вакуумную колбу, наполненную жидким азотом.

Используйте вакуумную колбу для переноски образца к спектрометру. Наполните сухую, теплоизолированную вакуумную колбу из пенопласта с широким горлышком 500 миллилитров на один литр жидкого азота. Возьмите криогенный флакон из колбы для переноса и держите его чуть выше поверхности жидкого азота, чтобы защитить его от атмосферы.

Держа криогенный флакон горлышком флакона слегка вниз, открутите крышку и дайте ротору скользнуть в ванну с жидким азотом. Предварительно охладите микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, погрузив ее в жидкий азот. С помощью пинцета под поверхностью ванны с жидким азотом переместите ротор в микроцентрифужную трубку так, чтобы приводной наконечник был обращен к дну пробирки, а маркировка была обращена к отверстию.

С помощью пинцета удерживайте трубку с ротором под жидким азотом за горлышко. С помощью второй пары пинцетов удерживайте ловушку ЯМР над поверхностью жидкого азота, наклоненной под острым углом по отношению к микроцентрифужной трубке. Чтобы перевести ротор из ловушки образцов ЯМР на спектрометр ЯМР, поместите криокамеру в режим выброса нажатием кнопки «Выброс».

Вставьте открытый конец ловушки образцов ЯМР в микроцентрифужную пробирку, пока она еще находится под поверхностью жидкого азота. Поднимите микроцентрифужную пробирку и ЯМР-улавливатель образцов, чтобы ротор упал в ловушку для проб. Встряхните улавливатель образцов и трубку, если ротор застрял на ободе

Оставьте пустую микроцентрифужную пробирку в верхней части ловушки образцов ЯМР, чтобы защитить ротор от воздуха. Снимите другой пустой уловитель проб с зонда и положите его на пол. Перенесите уловитель образцов ЯМР, содержащий ротор, в другую руку.

Затем извлеките микроцентрифужную трубку и сразу же вставьте ее в зонд. Подайте сигнал сотруднику, работающему с криокамерой, чтобы он нажал стоп, извлек и вставил. Раскрутите образец до желаемой скорости вращения, регулируя подшипник и давление потока.

Налейте от 500 миллилитров до одного литра жидкого азота в вакуумную колбу с широким горлышком для пены и поставьте ванночку под спектрометр. Опустите пустой криогенный флакон с кусочком папиросной бумаги в ванну с жидким азотом. Уменьшите скорость вращения до нуля килогерц, уменьшив поток приводного газа и газа подшипника, и выбросьте ротор, переключившись в режим выброса.

Не выключая режим выброса, снимите улавливатель проб с зонда и опустите ротор прямо в колбу с широким горлышком из пенопласта, содержащую жидкий азот. С помощью предварительно охлажденного пинцета перенесите ротор в предварительно охлажденный криогенный флакон под поверхность жидкого азота. Предварительно охладите крышку криогенного флакона, опустив ее в жидкий азот.

Извлеките флакон с ротором и жидким азотом из ванны и закройте пробирку предварительно охлажденной крышкой. Снова погрузите криогенный флакон в жидкий азот. Образец может быть перемещен в долгосрочное хранилище жидкого азота или немедленно распакован для дальнейшего анализа.

Криогенное введение предварительно замороженных образцов клеток млекопитающих в ЯМР-спектрометр поддерживает жизнеспособность на протяжении всего эксперимента ЯМР. При использовании этого протокола проницаемость трипанового синего клеток клеток млекопитающих после ЯМР MAS аналогична проницаемости клеток, не подверженных какому-либо изменению температуры. Если клетки медленно замораживают, а затем нагревают до комнатной температуры перед введением, клеточная жизнеспособность снижается до менее чем 10%.

При попытке выполнить протокол обратитесь за помощью с нажатием кнопки извлечения и вращением образца, чтобы образец можно было ввести в зонд до того, как он нагреется, убедившись, что в зонд не попадет влага, и будьте уверены, что спектрометр будет работать холодным в течение многих недель. Этот протокол применим к любым системам, в которых колебания температуры могут нарушить целостность образца, например, к реакциям замораживания, гашения или характеризации захваченных промежуточных продуктов реакции, ферментологии и сворачиванию белков.