4D-микроскопия: разгадка Caenorhabditis elegans Эмбриональное развитие с использованием микроскопии Номарского

4D-микроскопия является ценным инструментом для реконструкции полной клеточной линии эмбриона C.elegans или любого другого образца на уровне одной клетки. Оптика Nomarski может быть использована для выделения изменений формы клеток во время развития с помощью стандартного микроскопа и пропускаемого света без необходимости использования трансгенных животных или флуоресцентной микроскопии. 4D-микроскоп позволяет изучать цикл клеток, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз у C.elegans и в других системах, таких как млекопитающие или тканевые клеточные культуры.

Трассировка клеточной линии на DIC-изображениях выполняется вручную. Это занимает много времени и требует некоторой практики для проведения полного анализа эмбриона. Демонстрировать процедуру будет Бегона Эскурра, техник нашей лаборатории.

Перед подготовкой эмбрионов отрегулируйте температуру записи 4D-микроскопа на 15, 20 или 25 градусов Цельсия и настройте микроскоп на запись 1500, 30 фокальных плоскостей z-стеков на расстоянии одного микрона друг от друга с 30-секундными интервалами между началом каждой стопки. Далее налейте от 500 до 1000 микролитров жидкости 4,5%агар в трехмиллиметровые стеклянные пробирки и тщательно запечатайте пробирки восковой пленкой, чтобы избежать высыхания. Чтобы подготовить тонкую однородную агаровую прокладку для записи, тщательно нагрейте и нагрейте агар над спиртовой горелкой до тех пор, пока агар не расплавится, и поместите трубку в термоблок с температурой 80 градусов Цельсия.

Поместите предметное стекло для стеклянного микроскопа на кусок пластика и с помощью пастбищной пипетки в одной руке поместите небольшую каплю расплавленного агара в центр предметного стекла, затем сразу же используйте другую руку, чтобы поместить второе предметное стекло на каплю агара, чтобы создать очень тонкую агаровую прокладку. Чтобы поместить эмбрионы, сначала с помощью пикера перенесите от 5 до 10 гравидных гермафродитов в стакан часовщика, наполненный водой, под стереомикроскопом. С помощью скальпеля разрежьте гермафродитных нематод и извлеките от одной до четырех ранних яйцеклеток из матки.

Аккуратно снимите верхнюю горку с агаровой подушечки и с помощью капиллярной трубки поместите раннее яйцо в центр подушечки. Используйте ресницу, приклеенную к концу зубочистки, чтобы при необходимости отрегулировать положение яйца, и используйте капиллярную пипетку, чтобы удалить лишнюю воду. С помощью скальпеля медленно и наискось накиньте покровную прокладку на препарат, прежде чем использовать микропипетку, чтобы заполнить на 3/4 пространство вокруг агаровой прокладки водой.

Затем запечатайте защитное стекло вазелином, чтобы избежать высыхания при длительных периодах записи. После запечатывания поместите предметное стекло на предметный столик 4D-микроскопа и используйте объектив с малым увеличением, чтобы сфокусировать эмбрион. Выберите объектив 100-кратного погружения и сфокусируйте конденсор.

Полностью откройте апертуру конденсора и закройте диафрагму возбуждения, чтобы обеспечить более высокую числовую апертуру и большее разрешение. Поверните призму Волластона, чтобы получить трехмерное изображение эмбриона, освещенного с одной стороны, затем поверните призму в другом направлении, чтобы получить эффект освещения эмбриона с другой стороны, и начните 4D-запись. Для реконструкции клеточной линии эмбриона, записанного в 4D-фильме, откройте программу для отслеживания родословной и выберите «Файл» и «Новый проект».

Выберите подходящий шаблон происхождения клеток в зависимости от температуры записи и установите количество сканирований на 1500. Время между сканированиями до 30 секунд, количество уровней до 30, а расстояние между уровнями до одного микрона. Выберите файл изображения, формат и каталог, в котором были сохранены изображения.

Выберите, были ли изображения сохранены как отдельные изображения или как z-стеки с несколькими изображениями, а также задайте имена файлов и форматы изображений. Затем нажмите Обработка каналов включена, чтобы обнаружить и установить соответствующие световые каналы 4D-фильма. Для отслеживания клеточной линии запустите программное обеспечение для отслеживания клеточной линии.

Появится окно видео и окно происхождения клеток. В окне родословной выберите ветвь родословной и нажмите на соответствующее этой клетке ядро клетки в окне видео. Воспроизводите 4D-фильм вперед, назад, вверх или вниз по уровню, чтобы следовать за интересующей ячейкой в пространстве с течением времени.

Периодически нажимайте на ядро клетки, чтобы создать точку в ветви линии и зарегистрировать пространственные координаты клетки в определенный момент времени. В результате возможны прогрессии клеточной линии и 3D-реконструкции эмбриона. Затем нажмите клавишу ввода, чтобы отметить митоз, и выберите одну из дочерних клеток, чтобы проследить за развитием клеток, как показано выше.

Повторите анализ для остальных эмбриональных клеток, чтобы проследить полную клеточную линию или проследить за конкретными клетками, представляющими интерес, такими как те, которые подвергаются апоптозу. Для сравнения мутантных линий, представляющих интерес, со стереотипной линией клеток дикого типа C.elegans. Червячные пластины инкубируются в картонных коробках, чтобы избежать образования конденсата.

После завершения записи клеточная линия может быть реконструирована с помощью программного обеспечения для отслеживания родословной, как показано на рисунке. Например, в этом репрезентативном анализе прослеживаемая линия мутантных эмбриональных клеток gsr-1 сравнивалась с линией дикого типа C.elegans. И было выявлено обнаружение прогрессирующей задержки клеточного цикла во время эмбрионального развития.

Как следствие, мутантные эмбрионы останавливались на промежуточных стадиях, в то время как эмбрионы дикого типа прогрессировали и, наконец, вылуплялись в виде личинок. Кроме того, другие важные особенности эмбрионального развития, такие как апоптоз, могут быть динамически визуализированы с помощью 4D-микроскопии. Трассировка происхождения изображений DIC должна быть обработана вручную.

Программная обработка немаркированных клеток в видимом свете на ранних стадиях развития не является точной для анализа эмбрионов. Применение системы распознавания изображений в области микроскопии видимого света приведет к значительному прогрессу в области биологии развития.