Трансплантация внутримякардных инъекций MSC-Loading инъекционных гидрогелей после инфаркта миокарда в модели Murine

Этот метод может помочь решить ключевые проблемы в современной усугубленной кардиотерапии, такие как низкая применимость к низкой ретенции и выживаемость трансплантированных клеток в инфарктированных сердцах. Для решения этой проблемы этот метод может обеспечить надежную технику для изучения трансплантации интрамиокарда стволовыми клетками с использованием инъекционных гидрогелей на мышиной модели, что является отличной платформой для исследования восстановления сердечной ткани и регенерации после инфаркта миокарда. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она является целесообразным методом улучшения удержания и выживаемости трансплантированных стволовых клеток после внутримиокардиальной трансплантации с использованием инъекционных гидрогелей с поперечным покрытием in-situ.

Эти гидрогели предлагают разнообразные возможности для инженерии сердечной ткани, такие как доставка не только стволовых клеток, но и факторов роста, генетических материалов и лекарств для максимизации их терапевтического эффекта в инфарктированных тканях сердца. Демонстрировать процедуру эксперимента in vitro будет Ынми Ли, технолог-исследователь из моей лаборатории. Технологи-исследователи Ын Хе Пак и Ынхва Сон продемонстрируют процедуру проведения экспериментов in vivo.

Культивируйте мезенхимальные стволовые клетки, или МСК, в 100-миллиметровой чашке для культивирования при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Когда клетки достигнут 80% слияния, дважды вымойте посуду с DPBS и инкубируйте их с одним миллилитром заменителя трипсина при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Затем добавьте к клеткам девять миллилитров питательной среды и центрифугируйте их при 500-кратном G в течение трех минут.

Выбросьте образовавшуюся надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в одном миллилитре PBS и поддерживайте клеточную суспензию на льду. Разведите 10 микролитров клеточной суспензии с 10 микролитрами трипанового синего и определите концентрацию клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток.

Ресуспендируйте МСК до плотности один умножить на 10 до седьмой клетки на миллилитр и перенести их в пробирку объемом в один миллилитр. Приготовьте конъюгированный раствор с 6,25% GH в PBS и разделите его на два флакона. Затем смешайте растворы ГР с шестью микрограммами на миллилитр HRP или 0,07% перекисью водорода.

Кратковременно центрифугируют клеточную суспензию при 1000-кратном G и осторожно отсасывают полученную надосадочную жидкость. Затем смешайте гранулу ячейки с раствором ГР А. Загрузите МСК в раствор ГР А и раствор ГР В с обеих сторон двойного шприца. Поместите 300 микролитров комбинированных растворов ГР с МСК с конечной плотностью 5 миллионов клеток на миллилитр на предметное стекло с восемью лунками.

После образования гидрогеля in situ и последующей инкапсуляции МСК с помощью ферментативного сшивания добавьте 700 микролитров DMEM, содержащего 10% FBS и 1% антимикотический раствор антибиотика. Инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа и заменяйте питательную среду каждые два-три дня. Перед операцией деполируйте грудь мыши с помощью крема для удаления волос и простерилизуйте кожу йодом.

Поместите мышь на операционный стол и интубируйте ее, вставив катетер в трахею для обеспечения дополнительного кислорода с помощью искусственной вентиляции легких. Аккуратно разрежьте кожу хирургическими ножницами. Затем проникните в межреберные мышцы микроножницами.

Разделите второе и третье левое ребра с помощью шелкового шва 5-O, чтобы сохранить открытую грудную полость. Аккуратно перевязать левую переднюю нисходящую коронарную артерию с помощью иглодержателя с коэффициентом 8-0 Полипропиленовый шов и разрезать шов с помощью электрокаутеризации. Наблюдайте немедленное изменение цвета передней стенки левого желудочка.

После индукции инфаркта миокарда введите 10 микролитров раствора МСК, загрузив растворы ГР, в две разные точки в пограничной зоне инфаркта. Восстановите открытую грудную полость и закройте мышцы и кожу с помощью 5-0 швов. Удалите трахеальную трубку и поместите мышь в клетку под инфракрасную лампу на время восстановления.

Выполните эхокардиографию и измерьте соответствующие линии для передней стенки ЛЖ, внутренней стенки ЛЖ и задней стенки ЛЖ для получения толщины стенки сердца, размера камеры и фракционного укорочения. До трансплантации in vivo пролиферация и выживаемость МСК в гидрагелях ГР были подтверждены с помощью 3D анализа окрашивания живых мертвых клеток in vitro. Репрезентативные изображения продемонстрировали достаточную пролиферацию МСК, демонстрируя разветвленные сети внутри гидрогелей GH.

Обширная многоклеточная трехмерная структура МСК была отчетливо замечена на 14-й день, что указывает на то, что гидрогели ГР могут обеспечить надлежащую микросреду для инкапсулированных клеток. После индукции инфаркта миокарда в периинфарктные области интрамиокардиально были интрамиокардиально пересажены гидрогели МСК. МСК и гель были надлежащим образом поддержаны в области инфаркта.

МСК были хорошо интегрированы в гидрогели ГР. Для верификации терапевтических эффектов гидрогелей с нагрузкой МСК ГР изменения функции и структуры сердца оценивали с помощью эхокардиографии и гистологического анализа на 28-й день после трансплантации, а также сравнивали в различных группах лечения. Репрезентативная эхокардиография показала улучшение сердечных функций, включая фракционное укорочение, фракцию выброса и конечный систолический объем в группе, получавшей гель MSC.

Кроме того, гистологический анализ показал меньший фиброз, более толстые инфарктные стенки и меньший размер инфаркта в группе, получавшей гель МСК, чем в других группах, что указывает на то, что этот протокол значительно ослабляет ремоделирование ЛЖ. Используя эту методику, мы добились долгосрочного проникновения стволовых клеток и пролиферации, что привело к значительному улучшению структуры и функции сердца после инфаркта миокарда на мышиной модели. Этот метод может быть расширен для использования на крупных животных и для клинического применения в качестве новой стратегии профилактики постинфарктной сердечной недостаточности путем обеспечения восстановления и регенерации сердечной ткани.