Количественная оценка влияния противомикробных препаратов на архитектуру биопленки in vitro с помощью программного обеспечения COMSTAT

Значение этого протокола заключается в том, что он предлагает простую и воспроизводимую основу для количественного определения биопленочных структур in vitro в различных антимикробных условиях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он помогает устранить субъективные вариации, связанные с ручным управлением COMSTAT, что в конечном итоге способствует стандартизации и прозрачности экспериментов в исследовательских центрах. Для получения изображений культур Pseudomonas aeruginosa поместите планшет на предметный столик конфокального микроскопа, оснащенного соответствующими длинами волн лазерного возбуждения и наборами фильтров.

Используйте 20–25-кратный водно-иммерсионный объектив, чтобы получить не менее шести многослойных изображений z-стека от субстрата до вершины каждого сегмента биопленки с шагом 0,3 микрометра. Затем сохраните изображения в формате OME-TIFF для анализа COMSTAT. Когда все изображения будут получены, откройте пакет COMSTAT2 в ImageJ и создайте исходную папку на рабочем столе.

Добавьте один OME-TIFF в папку и откройте OME-TIFF из исходной папки. Удалите все пустые слои, не содержащие биомассы. Выберите «Файл», «Импорт» и «Последовательность изображений», чтобы импортировать файл в ImageJ.

Найдите и выделите исходную папку, не открывая ее, и нажмите «Выбрать». Появится окно с опциями последовательности, нажмите OK. Выберите «Изображение», «Трансформация» и «Отразить Z», чтобы изменить ориентацию биопленки так, чтобы субстрат находился на вершине стопки. Чтобы определить свойства изображения, выберите «Изображение и свойства», появится окно источника.

Укажите единицу длины в микронах, задайте глубину воксела как 0,3 и нажмите OK. Выберите «Изображение», «Настройка» и «Порог». Чтобы настроить порог изображения в окне порога, расположите нижний ползунок справа, чтобы вручную установить максимальное пороговое значение, и используйте верхний ползунок, чтобы установить минимальный порог. Затем с помощью ползунка в окне изображения прокрутите каждый слой, чтобы убедиться, что фоновый шум достаточно удален по всему стеку, и выберите «Установить», чтобы зафиксировать нижнее пороговое значение.

В окне установки пороговых уровней нажмите кнопку ОК, а также аналогичным образом установите и зафиксировайте максимальное пороговое значение. Выберите Применить, нажмите OK в появившемся окне преобразования стека в двоичный файл и выйдите из окна пороговых значений. Выберите «Подключаемые модули», «Биоформаты» и «Экспортер биоформатов», чтобы сохранить файл с новым именем в исходной папке.

Появится окно с несколькими файлами Bio-Formats Exporter, нажмите OK. Появится окно параметров экспортера биоформатов, снова нажмите OK. Чтобы запустить COMSTAT, выберите плагины и COMSTAT2, появится окно «О программе», выберите OK.In окне «Наблюдаемые директории», выберите «Добавить», найдите и выделите исходную папку, выделите и нажмите «Выбрать». Появится окно «Изображения в каталогах», в котором перечислены OME-TIFF для анализа.

В окне COMSTAT2.1 снимите флажки «Автоматическое пороговое значение», «Метод Оцу» и «Фильтрация подключенного объема», чтобы убедиться, что программное обеспечение использует предустановленные пороговые значения для отдельных OME-TIFF. В окне COMSTAT2.1 выберите «Биомасса», «Распределение толщины» и «Площадь поверхности» и нажмите «Перейти», чтобы запустить программу. Выходные данные будут отображаться в окне журнала.

Измерения будут автоматически сохранены в виде файлов TXT в исходной папке. В этом репрезентативном анализе был использован изолят Pseudomonas aeruginosa, культивируемый у инфицированного пациента с муковисцидозом, чтобы продемонстрировать сильные стороны этого подхода, неточно количественно оценивая антимикробные индуцированные изменения в архитектуре биопленки in vitro. Визуализация живых клеток также позволяет визуализировать изменения в структуре биопленки Pseudomonas aeruginosa до и после биопленочного специфического моноклонального лечения и лечения тобрамицином.

Анализ данных COMSTAT выявил существенные различия между обработанными структурами биопленки по сравнению с контрольными культурами. В культурах, обработанных тобрамицином, наблюдалось явное уменьшение средней толщины и биомассы. Однако в присутствии антител биопленка P.aeruginosa была устойчива к этим структурным изменениям, вызванным тобрамицином.

При исследовании поверхностного и биообъемного соотношения наблюдалось значительное снижение присутствия антител как в биопленках, подвергшихся воздействию тобрамицина, так и в неэкспонированных, что указывает на образование агрегатов в культурах, обработанных антителами. Эта процедура может быть выполнена для количественной оценки или сравнения эффектов различных противомикробных препаратов, используемых для разрушения биопленочных матриц. Используя этот метод в качестве общей основы, исследователи могут изучить различные способы уточнения протокола, включив в него новые математические модели и алгоритмические плагины в ImageJ, чтобы лучше отображать гетерогенность биопленки.