Выделение и функциональная оценка стволовых клеток рака молочной железы человека из образцов клеток и тканей

Этот метод позволит исследователям изолировать стволовые клетки рака молочной железы с максимальной чистотой и жизнеспособностью для проведения анализов функциональной характеристики как in vitro, так и in vivo. Изолированные стволовые клетки рака молочной железы также могут быть использованы для выяснения молекулярных событий, которые контролируют онкогенность и метастазирование, а также для разработки терапевтических стратегий, нацеленных на эти клетки. С незначительными изменениями, специфичными для интересующих типов клеток и тканей, этот метод также может быть применен к другим системам.

Чтобы получить одиночную клеточную суспензию из клеточной культуры, промойте 80%-ную конфлюентную культуру клеток рака молочной железы PBS и обрабатывайте клетки соответствующим раствором для диссоциации клеток в течение пяти минут при комнатной температуре. После того, как клетки отделятся, добавьте пять миллилитров питательной среды для нейтрализации раствора для диссоциации клеток и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров для центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах PBS для подсчета.

После подсчета снова центрифугируйте клетки, затем повторно суспендируйте клетки в соотношении от 10 до шести клеток на миллилитр субстратного буфера ALDH. Чтобы получить суспензию одной клетки из образца ткани, используйте хирургические лезвия в технике крест-накрест, чтобы измельчить опухолевую ткань на кусочки размером примерно в один миллиметр. Поместите кусочки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 10 миллилитров буфера для диссоциации.

Запечатайте пробирку парапленкой на 40-минутную инкубацию при температуре 37 градусов Цельсия в шейкере и осадите переваренные кусочки ткани центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах трипсина с помощью пятимиллилитровой пипетки и инкубируйте ткань на водяной бане при температуре 37 градусов в течение пяти минут. В конце инкубации энергично пипетируйте ткань несколько раз, чтобы высвободить отдельные клетки, и добавьте достаточное количество среды DMEM/F-12, чтобы довести общий объем в пробирке до 25 миллилитров.

Соберите клетки центрифугированием, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре Displace DNAse и инкубируйте в течение пяти минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. По окончании инкубации доведите общий объем до 10 миллилитров с помощью PBS. Смешайте клетки с помощью пипетирования и пропустите их через клеточное сетчатое фильтр 40 микрон в 50-миллилитровую пробирку.

После центрифугирования повторно суспендируйте клетки в пяти миллилитрах свежего PBS для подсчета. Чтобы провести колониеобразующий анализ, после сортировки повторно суспендируйте клетки в полной среде и добавьте соответствующее количество стволовых клеток рака молочной железы в каждую из трех пробирок, содержащих два миллилитра среды на пробирку, помеченную один раз по 10 секунд, два раза по 10 со второй или пять раз по 10 со вторыми клетками. Пипеткой вверх и вниз пять раз тщательно перемешайте клеточную суспензию и поместите клетки в отдельные лунки шестилуночного планшета.

Осторожно поворачивайте планшет, чтобы получить равномерное распределение клеток, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур до тех пор, пока не появятся колонии. В конце инкубации промойте клетки одним миллилитром PBS на лунку и окрашивайте клетки 500 микролитрами 0,05%-ного раствора кристаллической фиалки на лунку в течение 30 секунд. В конце инкубации промойте лунки два раза двумя миллилитрами воды на лунку, чтобы удалить избыток красителя, а также подсчитайте и запишите общее количество колоний в лунке с помощью световой микроскопии с четырех- или 10-кратным увеличением.

Для проведения маммосферного анализа, после сортировки, повторно суспендируйте клетки в полной маммосферной среде и потратьте их с плотностью посадки пять раз по 10 вторых клеток на квадратный сантиметр площади на лунку в 96-луночном планшете для культивирования клеток со сверхнизким прикреплением. Перед подсчетом количества маммосфер в лунке с помощью световой микроскопии поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 5-10 дней. Чтобы настроить 3D-модель культуры, осторожно добавьте 50 микролитров экстракта базальной мембраны в каждую лунку 96-луночного планшета без пузырьков и поместите планшет при температуре 37 градусов Цельсия на один час, чтобы раствор мог полимеризоваться.

Добавьте 100 микролитров PBS через 10 минут, чтобы избежать высыхания гелевого слоя. По окончании инкубации отсортированные клетки суспендируют до 5-50 умножить на 10-треть клеток на 200 мкл 3D питательной среды концентрации и заменить PBS в каждой лунке 96-луночного планшета на 200 мкл среды, содержащей клетки. Затем поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 10-14 дней перед оценкой культур на предмет образования органоидов.

Клетки рака молочной железы человека, которые проявляют повышенную ферментативную активность ALDH, экспрессируют высокие уровни CD44 и низкие или отрицательные уровни экспрессии CD24 и могут быть классифицированы как стволовые клетки рака молочной железы. Доля стволовых клеток рака молочной железы в общей популяции может варьироваться в зависимости от клеточных линий или пациентов и часто зависит от стадии заболевания, при этом более агрессивный рак молочной железы обычно демонстрирует более высокую долю стволовых клеток рака молочной железы. Способность одной клетки рака молочной железы к самообновлению и образованию колоний из 50 клеток может быть оценена с помощью колониеобразующих анализов.

Способность стволовых клеток рака молочной железы к самообновлению в независимых от якоря экспериментальных условиях может быть оценена с помощью маммосферных анализов. Культивирование клеток рака молочной железы и экстракт базальной мембраны позволяют стволовым клеткам рака молочной железы формировать трехмерные структуры, которые повторяются в условиях in vivo. Кроме того, модели ксенотрансплантатов мышей in vivo могут быть использованы для понимания различий в росте, самообновлении, дифференцировке и/или способности стволовых клеток рака молочной железы инициировать опухоль по сравнению со стволовыми клетками, не относящимися к раку молочной железы, или популяциями объемных клеток.

После этой процедуры выделенные стволовые клетки рака молочной железы могут быть использованы в транскриптомных, киномических и метаболомных исследованиях. Этот метод дает исследователям возможность изучить роль стволовых клеток рака молочной железы в инициации опухоли, метастазировании, рецидиве и резистентности к терапии.