Трехмерная модель сфероидов для изучения стволовых клеток рака толстой кишки
22 января 2021 г.
Этот протокол представляет собой новую, надежную и воспроизводимую культурную систему для генерации и выращивания трехмерных сфероидов из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2. Результаты обеспечивают первое доказательство-концепции для целесообразности этого подхода к изучению биологии раковых стволовых клеток, в том числе ответ на химиотерапию.
Этот новый метод сфероидных культур может быть использован для изучения опухолевой для анализа присутствия различных популяций раковых стволовых клеток, а также может быть красиво применяется для через высокий экран положить для новых препаратов. Это надежная и повторяющаяся культурная система для генерации большого количества однородных сфероидов. Кроме того, эти сфероиды могут быть использованы для изучения раковых стволовых клеток.
Этот метод создан для изучения биологии хронического рака, но он может быть легко создан для изучения других видов рака путем изменения условий 3D культуры. Будьте уверены, чтобы следить за пузырьками в среде, чтобы не перемещать пластину слишком много во время образования сфероидов и быть осторожным при сборе сфероидов в ситечко. Начните с предварительной лечения скважин 24 пластины скважины с 500 микролитров анти-Adherence Rinsing решение на скважину.
Через несколько секунд центрифуга пластины в размахивая-ведро ротора и промыть каждый колодец с 2 миллилитров теплой базальной среды. Наблюдайте за пластиной под микроскопом, чтобы убедиться, что пузырьки были полностью удалены из микро скважин. Если пузырьков не наблюдается, промыть скважины снова, прежде чем добавить один миллилитр теплой DMEM подвале мембраны матрицы среды для каждой скважины.
Чтобы вызвать образование сфероидов, увидеть желаемую концентрацию клеток Како-2 в 2D монослой в 10 сантиметров блюдо в DMEM дополняется 10%FBS и 1%антибиотиков. Для культуры при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе во влажной атмосфере. Когда 80%-ного слияния достигнут, мыть клетки с пятью миллилитров PBS перед лечением культуры с двумя миллилитров трипсина-ЭДТА в течение двух-пяти минут при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа.
Когда клетки отделились нейтрализовать трипсин с четырьмя миллилитров полного DMEM. После подсчета, собирать клетки центрифугации и повторно использовать палитру в соответствующем объеме DMEM подвале мембраны матрицы среды для достижения желаемой концентрации клеток в один миллилитр среднего на колодец. Добавить один миллилитр клеток к каждому хорошо предоплаченных 24 хорошо пластины, а затем добавление одного миллилитра DMEM подвале мембраны матрицы среды для каждого хорошо.
После посева немедленно центрифуга пластины и использовать световой микроскоп, чтобы убедиться, что клетки были равномерно распределены по микро скважин. Затем поместите пластину в инкубатор клеточной культуры в течение 48 часов, не нарушая клетки. Для сбора сфероидов, в конце инкубации, используйте серологическую пипетку и половину супернатанта в каждой скважине, чтобы аккуратно выбить сфероиды из их микро скважин.
Когда все сфероиды были отделены использовать пипетку, чтобы тщательно передать 3D культур из каждого хорошо до 37 микрон обратимый ситечко на вершине 15 миллилитров конической трубки. Вымойте каждый хорошо три раза с одним миллилитром довоенной базальной среды на стирку, чтобы собрать все оставшиеся сфероиды и добавить эти дополнительные сфероиды в ситечко. После последней стирки проверьте пластину под микроскопом, чтобы подтвердить, что все сфероиды были удалены из микро скважин.
Затем инвертировать ситечко над новой 15 миллилитровой трубки и мыть дно ситечко со свежим DMEM подвале мембраны матрицы среды для сбора сфероидов в трубку. Сфероиды поднимаются из 500 клеток демонстрируют наиболее однородное увеличение размера с течением времени. С 500 и 600 клеток на сфероид определить, чтобы быть оптимальное количество клеток, под которыми хороший рост и низкая изменчивость может быть достигнуто.
Добавление мембранной матрицы подвала усиливает рост сфероидов и однородность. В долгосрочной культуре клетки выглядят как плотные многослойные на третий день. В то время как сплющенные клетки, расположенные в монослоев хорошо видны на 10 день.
Интересно, что люмен появляется в сфероидах с пяти-го дня. Кроме того, явное увеличение размножающихся клеток ядерных антигенных положительных клеток наблюдается в дни пять и семь, что снижается на 10-й день. Удивительно, но активированный Caspace 3 наблюдается в очень немногих клетках только в три и пять дней.
В то время как высокие уровни бета-катенина выражения наблюдаются в каждый момент времени. О потенциале сфероидов дифференцироваться в антерозиты свидетельствует их щелочная фосфатаза и растворимое семейство носителей 2A5 mRNA. Кроме того, эти сфероиды выражают типичные маркеры стволовых клеток рака и реагируют на комбинированные химиотерапии, которые обычно вводят пациентам с колоректальным раком.
Таким образом, сфероиды состоят из различных популяций клеток. Затем они могут быть хорошо использованы для анализа клеточных специфических реакций на раздражители, такие как огнеупоры и в конечном итоге для реакции на наркотики.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлена надежная система культивирования для получения трехмерных сфероидов из клеток аденокарциномы толстой кишки Caco2. Этот метод позволяет изучать биологию раковых стволовых клеток и их ответ на химиотерапию.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Онкология
- Клеточная биология
Теоретические основы
- Понимание природы раковых стволовых клеток имеет решающее значение для разработки эффективных методов терапии.
- 3D-культуры сфероидов имитируют условия опухолевого микроокружения in vivo.
- Данный метод может быть адаптирован для различных типов рака.
- Стабильность и воспроизводимость результатов являются необходимыми условиями для обеспечения достоверности экспериментов.
Цель исследования
- Установление надежного метода культивирования сфероидов из клеток Caco2.
- Исследование туморогенности и популяций раковых стволовых клеток.
- Обеспечение возможности проведения высокопроизводительного скрининга новых лекарственных препаратов.
Используемые методы
- Предварительная обработка лунок раствором для промывки, предотвращающим адгезию.
- Осторожное обращение во избежание образования пузырьков при формировании сфероидов.
- Сбор сфероидов с помощью сита.
- Мониторинг условий культивирования для обеспечения оптимального роста.
Основные результаты
- Успешное получение сфероидов однородного размера.
- Продемонстрированная применимость для изучения раковых стволовых клеток.
- Потенциал для использования в скрининге лекарственных препаратов.
- Возможность адаптации для других типов рака путем изменения условий культивирования.
Выводы
- Данный метод предоставляет новый инструмент для исследований рака.
- Он расширяет понимание динамики раковых стволовых клеток.
- В будущих исследованиях эта система может быть использована для разработки терапевтических методов.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данная 3D-модель сфероидов отвечает критической потребности в доклинических системах, воспроизводящих гетерогенность опухоли и фенотипы раковых стволовых клеток (РСК), что позволяет проводить более прогностическую оценку терапевтических мишеней и ответов на лекарственные препараты в исследованиях колоректального рака. Обеспечивая воспроизводимую платформу для длительного обогащения РСК и оценки ответа на химиотерапию, данный метод поддерживает усилия по валидации мишеней и идентификации перспективных соединений на ранних стадиях с повышенной трансляционной достоверностью.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать гетерогенность CSC и их туморигенный потенциал посредством анализа паттернов дифференциальной пролиферации и образования просветоподобных структур внутри сфероидов.
- Практическая ценность: способствует функциональной валидации мишеней за счет обогащения популяции CSC, экспрессирующих установленные маркеры, что облегчает механистическое снижение рисков при проверке терапевтических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать сфероиды однородного размера из определенного количества клеток, создавая стандартизированную систему для количественного анализа ответа на лекарственные препараты.
- Практическая ценность: Совместим с рабочими процессами высокопроизводительного скрининга благодаря стабильности, воспроизводимости и простоте сбора сфероидов с использованием методов фильтрации.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Демонстрирует экспрессию маркеров РСК и ответ на клинически значимую комбинированную химиотерапию, что позволяет осуществлять доклиническое моделирование резистентности и чувствительности к лечению.
- Практическая ценность: Сохраняет фенотипы РСК при длительном культивировании, обеспечивая возможность проведения лонгитюдных исследований эффективности препаратов и механизмов рецидивирования опухоли.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез о мишенях через идентификацию ведущих соединений до доклинической валидации, особенно для онкологических программ, сосредоточенных на терапии, направленной против CSC, и механизмах резистентности.
- Открывающая биология: способсвует уточнению сигнальных путей и снижению биологических рисков за счет моделирования ниш CSC и дифференциальных ответов на препараты в 3D-контексте.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию анализа благодаря формированию однородных по размеру сфероидов, что позволяет проводить надежный скрининг соединений на популяциях, обогащенных CSC.
- Аналитика: обеспечивает количественные показатели экспрессии маркеров CSC, маркеров пролиферации (PCNA) и маркеров апоптоза (активированная Caspase-3) для сравнения условий терапии.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническим этапом за счет моделирования ответа на химиотерапию в релевантной системе заболевания, которая отражает гетерогенность аденокарциномы толстой кишки.
- Корпоративное повторное использование: адаптируема для других типов рака путем модификации условий 3D-культивирования, что позиционирует данный метод как универсальную платформу для различных программ по поиску противоопухолевых средств.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет учета опухолевой гетерогенности, обусловленной CSC, и функциональных свойств стволовости, которые отсутствуют в 2D-моделях.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированному посеву, предварительной обработке антиадгезивными агентами и сбору с использованием фильтров, что снижает вариабельность при создании сфероидов.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет возможности ранней оценки соединений, нацеленных на CSC, и механизмов резистентности, что снижает биологические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию перспективных соединений с поправкой на риск на основе данных о модуляции CSC и ответе на химиотерапию в физиологически релевантной модели.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами трехмерного (3D) культивирования клеток, включая обработку поверхностей для предотвращения адгезии и осторожное обращение с образцами во избежание образования пузырьков воздуха при инициации сфероидов.
- Необходим доступ к матриксу базальной мембраны (например, Matrigel) и стандартному оборудованию для культивирования клеток, включая центрифуги, фильтры-сетки (37 micron) и инвертированные микроскопы для мониторинга.
- Необходима межкомандная стандартизация плотности посева (500–600 cells/spheroid) и времени инкубации для обеспечения гомогенности и воспроизводимости результатов во всех экспериментах.
- Адаптация метода для других типов рака требует оптимизации концентрации матрикса базальной мембраны и продолжительности культивирования с учетом адгезии и кинетики формирования сфероидов для конкретной клеточной линии.
- Практические ограничения включают необходимость осторожного обращения при сборе образцов во избежание разрушения сфероидов, а также возможную вариабельность времени формирования просвета (люмена) в разных партиях.
