Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Пептогликомика использует передовую масс-спектрометрию в сочетании с мощным биоинформационным анализом данных для изучения состава пептидогликанов в мельчайших деталях. Использование биоинформационных алгоритмов позволяет анализировать, извлекать и сравнивать массовые данные в наборе файлов данных одновременно, снижая рабочую нагрузку и повышая точность. Понимание различных вариаций и модификаций пептидогликана имеет значение для понимания клеточных процессов, включая рост и деление, уклонение от иммунитета хозяина и устойчивость к противомикробным препаратам.

Мы рекомендуем сначала подготовить и проанализировать небольшую подгруппу образцов, чтобы ознакомиться с протоколом и выступить в качестве пилотного проекта для оценки экспериментальных параметров. Поскольку программное обеспечение для анализа данных масс-спектрометрии часто различается по определениям, используемым при описании особенностей и функций, визуальная демонстрация поможет пользователям применять этот протокол на разных платформах. Для экстракции пептидогликана саккули ресуспендируют замороженные клеточные гранулы в концентрации примерно от одного до 10 от первоначального объема культуры в 20 миллимолярном фосфате натрия при четырех градусах Цельсия перед добавлением клеточной суспензии по каплям до кипячения 8% SDS в 20 миллимолярном фосфате натрия до конечного объема один к одному.

Поддерживайте слабый кипение от 30 минут до трех часов при помешивании, чтобы обеспечить полную диссоциацию мембраны. Полученная смесь должна быть абсолютно прозрачной, без остатков клеточных комочков или вязкости. Когда раствор остынет до комнатной температуры, соберите саккули с помощью ультрацентрифугирования, после чего следует пять-семь стирок в концентрации примерно 50 миллилитров 20 миллимолярного фосфата натрия комнатной температуры на одну стирку до тех пор, пока буфер для промывки не достигнет концентрации SDS приблизительно 0,001%, как определено колориметрическим красителем.

После последней промывки ресуспендируйте саккули в 5-10 миллилитров 20 миллимолярного фосфата натрия комнатной температуры и добавьте в образец 50 микрограммов на миллилитр амилазы, ДНКазы и РНКазы в 10 миллимолярных сульфатах магния в течение одного часа с перемешиванием или нутацией при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации переварите реакцию в течение ночи со 100 микрограммами на миллилитр проназы при температуре 37 градусов Цельсия. На следующее утро после ультрацентрифугирования прокипятите образец в течение часа в 25 миллилитрах 2% SDS и 20 миллимолярах фосфата натрия в пароварке.

В конце инкубации промойте образец пять-семь раз 50 миллилитрами дважды дистиллированной воды комнатной температуры, как показано на рисунке. Когда концентрация SDS достигнет примерно 0,001%, ресуспендировать гранулу в достаточном количестве дважды дистиллированной воды до получения суспензии саккули и промыть емкость. После ночного хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия лиофилизируйте замороженный образец перед тем, как разбавить саккули до 10 миллиграммов пептидогликана на миллилитр двойной концентрации дистиллированной воды.

Для анализа LC-MS начните новый проект в программном обеспечении прибора и назначьте соответствующие файлы данных LC-MS QTOF интересующим экспериментальным условиям. Запустите мастер обработки данных, пакетное рекурсивное извлечение признаков и настройте фильтры обработки данных в соответствии с параметрами условий ЖХ-МС и приборами для точной идентификации групп и проверки пиков соотношения массы к заряду, представляющих отдельные муропектиды. Просмотрите результаты в конце извлечения признаков.

Если значительное количество объектов не удалось выровнять в группе, при необходимости настройте параметры рекурсивной фильтрации, чтобы расширить или ограничить окно обнаружения. Затем экспортируйте данные в виде составного обменного файла. Для анализа дифференциальных спектральных признаков начните новый проект в системном программном обеспечении и следуйте инструкциям по импорту данных.

Во время анализа данных выберите значение и кратное изменение для дифференциального анализа и установите для исходных данных медианную интенсивность во всех файлах данных. После завершения анализа изучите полученные графические и статистические анализы, чтобы выявить муропептиды, которые демонстрируют значительное изменение содержания между тестируемыми экспериментальными условиями. В навигаторе проекта щелкните правой кнопкой мыши по различным анализам и выберите опцию экспорта, чтобы сохранить детали объекта в виде файла tsv.

Убедитесь, что вы сохранили несколько анализов, чтобы получить все необходимые данные. В программном обеспечении для дифференциального анализа в разделе интерпретации результатов выберите браузер идентификаторов, добавьте библиотеку ожидаемых структур муропептида и выберите параметры, аналогичные продемонстрированным для извлечения признаков, чтобы получить предсказанную аннотацию муропептида для каждого идентифицированного признака. Чтобы вручную подтвердить предсказанную аннотацию муропептидов, сравните пики отношения массы к заряду тандемной масс-спектрометрической хроматограммы с предсказанным отношением массы к заряду всех возможных фрагментаций известной структуры муропептида.

С помощью молекулярного редактора нарисуйте предсказанную структуру муропептида с помощью инструмента масс-фрагментации, чтобы показать отношение массы к заряду фрагментов масс-спектрометрии, когда каждая связь разрывается по отдельности или в комбинации, а затем сравните все возможные фрагментации структуры муропептида с тандемной масс-спектрометрической хроматограммой. Чтобы подтвердить аннотацию муропептида, пики отношения массы к заряду нескольких фрагментов должны быть найдены на хроматограмме тандемной масс-спектрометрии с очень минимальным окном выравнивания отношения массы к заряду. Чтобы оценить глобальные изменения в модификациях муропептидов, отредактируйте файл tsv статистически значимых высокократных изменений муропептидов, включив в него один столбец для каждой модификации муропептида.

Заполните этот столбец обозначением для каждого аннотированного муропептида и загрузите измененный файл tsv в Perseus. В разделе Аннотации строк щелкните Категориально аннотировать строки и добавьте файлы данных к каждому экспериментальному параметру. Затем в разделе «Тест» нажмите на два образца тестов, чтобы выполнить Т-тест учащегося, и нажмите «1D», чтобы выполнить 1D-аннотацию.

Повышенная чувствительность обнаружения масс-спектрометрического оборудования в сочетании с мощным программным обеспечением для распознавания пиков улучшили способность изолировать, контролировать и анализировать состав веществ сложных образцов в мельчайших деталях. Связывание каждого пика массы-заряда, извлеченного из данных масс-спектрометрии, с конкретным муропептидом облегчается путем перекрестных ссылок с базой данных известных и предсказанных структур муропептидов. Фрагментационная тандемная масс-спектрометрическая хроматограмма для каждого выделенного признака может быть сопоставлена с профилем фрагментации муропептида, предложенным с использованием базы данных.

Графики вулканов могут быть использованы для выделения муропептидов, которые демонстрируют статистически значимую высокую величину изменения численности между исследуемыми условиями. При совместном рассмотрении несколько муропептидов, обладающих одной и той же модификацией, могут быть исследованы на предмет тенденции к одному экспериментальному состоянию, а вся группа может быть оценена на предмет значимости. Отслеживание модификации муропептида таким образом может идентифицировать конкретную ферментативную активность, на которую влияет экспериментальный параметр.

Кроме того, выбросы из этого тренда могут выявлять ферментативную активность с определенной специфичностью или биологической функцией. Эта процедура исследует биохимические изменения и биологические вариации в полимерах, тем самым давая представление о ферментативной активности, возникающей на PG in vivo. Детальное изучение состава PG поможет понять сложные клеточные структуры, которые имеют значение для многих критических физиологических процессов.