Трансиллюминация-помощь рассечение конкретных этапов мыши seminiferous эпителиального цикла для downstream иммуностенсивных анализов

Этот метод облегчает идентификацию и препарирование специфичных для стадий сегментов семенных труб, что позволяет изучать очень специфические этапы сперматогенеза. Стадии семенного эпителиального цикла могут быть распознаны в свежих, нефиксированных канальцах, и, следовательно, мы можем выбрать только те стадии, которые представляют интерес для последующих анализов. Требуется некоторая практика, чтобы научиться распознавать стадии на основе их транслюминационных паттернов, но этот протокол должен обеспечить вам успех.

Демонстрировать процедуру будет Опейеми Олоту, который является кандидатом наук в моей лаборатории. Начните с того, что поместите по крайней мере 8-недельного взрослого самца мыши в положение лежа на спине и продезинфицируйте брюшную полость с помощью 70% этанола. С помощью стерильных ножниц сделайте V-образный разрез в области брюшной области таза, а с помощью стерильных щипцов потяните за придаток яичка, чтобы найти яички.

С помощью ножниц препарируйте яички, помещая ткани в стерильную 100-миллиметровую чашку Петри с PBS по мере их сбора. С помощью ножниц с тонким наконечником вырежьте разрез в белочной оболочке, толстом волокнистом листе, инкапсулирующем яички, и используйте щипцы, чтобы разорвать оболочку и выдавить канальцы наружу. Поместите декапсулированные семенные трубочки в новую чашку Петри и добавьте достаточное количество стерильных PBS, чтобы покрыть дно чашки.

Затем с помощью щипцов аккуратно раздвиньте канальцы, не повреждая ткани. Для рассечения канальцев прикрепите чашку к предметному столику для препарирования микроскопа и включите трансиллюминацию. С помощью тонких щипцов осторожно перемещайте пучки канальцев, чтобы ознакомиться с моделями поглощения и рассеяния света на различных стадиях.

Затем с помощью щипцов с крючковатым концом приподнять интересующую канальцу и с помощью ножниц для микродиссекции отрезайте сегмент соответствующей длины. После разрезания сегментов канальцев, специфичных для предметной области, с помощью пипетки соберите интересующий сегмент в объеме PBS объемом 10 микролитров и поместите сегмент на предметное стекло микроскопа. Осторожно прижмите покровное стекло размером 20 на 20 миллиметров к канальцу, не слишком сжимая ячейки, и поместите предметное стекло на предметный столик фазово-контрастного микроскопа.

Поместите фильтровальную бумагу на край покровного стекла, чтобы облегчить растекание ячеек в монослой, и используйте объектив 40 раз для проверки этапов клетки. Как только клетки сформируют круглый монослой с обоих концов канальца, опустите предметное стекло в емкость с жидким азотом на 10 секунд. С помощью скальпеля снимите защитное стекло с ячеек и немедленно поместите предметное стекло в 90% этанол на 2-5 минут.

Затем высушите на воздухе и храните предметное стекло при комнатной температуре до нескольких дней. Для полного иммуноокрашивания семенных канальцев используйте пипетку для переноса интересующих сегментов в 15-миллилитровую коническую трубку с ледяным PBS на льду. Дав сегментам отстояться, осторожно удалите PBS.

Добавьте 10 миллилитров свежего ледяного PBS и перемешайте методом инверсии. Дайте канальцам осесть в течение нескольких минут, прежде чем снова удалить надосадочную жидкость, как показано на рисунке. Когда вся надосадочная жидкость будет удалена, зафиксируйте канальцы в 5 миллилитрах параформальдегида на пять часов со скоростью от 20 до 30 оборотов в минуту при температуре 4 градуса Цельсия.

В конце инкубации дайте канальцам отстояться в течение нескольких минут, прежде чем трижды промыть образец в свежем PBS при температуре 4 градуса Цельсия в течение 10 минут за промывку с вращением. После последнего промывки с помощью пипетки объемом 1 миллилитр перенесите от 10 до 20 неподвижных сегментов канальцев в 2-миллилитровую трубку с круглым дном. Когда сегменты осядут, замените надосадочную жидкость 1 миллилитром 2% БСА и 10% FBS в PBSX на одну часовую инкубацию при комнатной температуре и от 20 до 30 оборотов в минуту.

По окончании блокирующей инкубации промойте образцы 1 миллилитром PBSX. Перед тем, как пометить канальцы 250 микролитрами первичного антитела, разведите его в 1% BSA в PBSX в течение двух часов при комнатной температуре от 20 до 30 оборотов в минуту. В конце инкубации канальцы трижды промывают в PBSX, как показано на рисунке, перед маркировкой образцов 250 микролитрами соответствующих вторичных антител в течение одного часа, защищенного от света при комнатной температуре и со скоростью от 20 до 30 оборотов в минуту.

В конце инкубации трубочки трижды промыть перед сцеживанием трубочек на предметное стекло микроскопа в небольшом объеме надосадочной жидкости. Затем с помощью наконечников для загрузки геля расположите канальцы в линейные полосы и слейте лишний буфер. Затем добавьте от 1 до 2 капель монтажного средства перед установкой предметного стекла с покровным стеклом.

При транслюминации стадии с 7 по 8 кажутся однородно темными, поскольку они содержат большое количество полностью конденсированных удлиненных сперматид, которые выровнены на апикальной поверхности эпителия. После того, как зрелые сперматозоиды высвобождаются в просвет во время сперматозоидов, канальцы выглядят очень бледными на стадии с 9 по 10 из-за отсутствия конденсированных удлиненных сперматид в эпителии. За этой бледной зоной следует зона слабых пятен, пятнистый вид которой обусловлен организацией удлиненных сперматид с конденсированным хроматином в пучках.

Эти пучки становятся очень заметными в последующей зоне сильного пятна. Сперматидные пучки мигрируют к ядрам клеток Сертоли, расположенным близко к базальной пластинке, что отражается в виде полосатого вида канальцев от 2 до 5 стадии при транслюминации. Пучки окончательно рассеиваются на стадии 6, и конденсирующиеся удлиняющиеся сперматиды приближаются к просвету, чтобы быть высвобожденными из эпителия на стадии 8.

Точная стадия сегмента канальца может быть точно проверена с помощью фазово-контрастной микроскопии препаратов кабачков. Иммуноокрашивание стадийных препаратов патиссонов может быть использовано для изучения экспрессии и локализации представляющих интерес белков в семенном эпителии. Окрашивание семенных канальцев целиком обычно используется для изучения типов клеток, которые контактируют с базальной мембраной семенного эпителия, либо на трубчатой, либо на интерстициальной стороне.

Метод также может быть использован для изучения клеток или структур, расположенных глубже в эпителии, таких как гемато-яичковый барьер или постмейотические половые клетки. В дополнение к иммуноокрашиванию, мы можем использовать стадийные сегменты труб для многих других последующих анализов, включая биохимические анализы РНК и белков, проточную цитометрию и культуру труб ex vivo. Поскольку этот метод позволяет проводить очень подробный анализ сперматогенеза, он действительно предоставляет полезный инструмент для изучения всех важных процессов, необходимых для производства спермы и мужской фертильности.