Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе
21 февраля 2021 г.
Мы представляем два различных протокола окрашивания для обнаружения лиганда NKG2D (NKG2DL) в образцах первичного острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) человека. Первый подход основан на слиянии белка, способного распознавать все известные и потенциально еще неизвестные лиганды, в то время как второй протокол основан на добавлении нескольких антител против NKG2DL.
Этот протокол показывает два различных способа обнаружения NKG2DL на поверхности клеток AML. Этот метод обеспечивает быстрый, удобный для пользователя метод окрашивания для обнаружения всех известных и, возможно, неизвестных NKG2DL. Этот метод позволяет отделить лейкемические стволовые клетки от объемных AML-клеток, что позволяет дополнительно охарактеризовать эти клетки.
Начните с размораживания биотина и белковых пробирок NKG2D при комнатной температуре. Быстро раскрутите порошок NKG2D FC, затем добавьте 500 микролитров PBS, чтобы восстановить порошок и тщательно перемешать с помощью микропипетки P-1000. Добавьте 100 микролитров слиткового белка NKG2DL в биотиновую трубку для получения конечной концентрации 10 микрограммов на миллилитр и тщательно перемешайте раствор с микропипеткой P-100.
Чтобы разморозить клетки AML, удалите криовиал, содержащий первичный ОМЛ, из хранилища жидкого азота и немедленно поместите его на водяную баню с 37 градусами Цельсия. Осторожно перемещайте трубку вперед и назад в воде, позволяя содержимому флакона оттаивать, пока не останется только небольшой кристалл льда. Немедленно переложите размороженные клетки в среду, содержащую трубку, и промойте флакон, используя один миллилитр среды.
Центрифугирование клеток в 300 раз G в течение 10 минут и выбросьте супернатант, не нарушая гранулу. Промыть ячейки пятью миллилитрами rpmi среды, содержащей 10% FCS, и повторить центрифугирование. Повторно суспендируют ячейку гранулы с буфером окрашивания до конечной концентрации 0,5 раза 10 до седьмой клетки на миллилитр.
Затем переложите 100 микролитров клеточной суспензии на клеточную культуру 96 лунки U-нижней пластины и центрифугируют пластину в 300 раз G в течение 10 минут. Выбросьте супернатант, не нарушая гранулу. Приготовьте мастер-смесь биотинилированного белка слияния NKG2D таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 микролитров на лунку с конечной концентрацией NKG2D 10 микрограммов на миллилитр на лунку.
Добавьте приготовленную мастер-смесь и повторно суспендировать гранулы ячейки пипеткой 200 микролитр. Инкубируйте и центрифугируйте пластину, как описано в тексте рукописи. Приготовьте мастер-микс с использованием стрептавидина ПЭ так, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 микролитров.
Добавьте мастер-микс в ячейки и повторно суспендировать гранулы многоканальной пипеткой 300 микролитра. После центрифугирования пластины и выброса супернатанта используйте 300-микролитровый многоканальный микропипетку для повторного суспендирования гранул ячейки в 200 микролитрах буфера окрашивания плюс 7-AAD. Затем проанализируйте клетки с помощью устройства проточной цитометрии.
Проанализированные образцы AML положительны на CD34 и NKG2DL, но также существуют отрицательные субпопуляции, в общей сложности четыре разные популяции. Типичная стратегия гастина начинается с отбора основной популяции клеток через их FSC и SSC. Дублеты и мертвые клетки исключаются из последующего анализа.
Ворота настраиваются с помощью элементов управления FMO для обеспечения надлежащей идентификации положительных ячеек. Здесь выделены интенсивности флуоресценции клеток, положительных для CD34 по сравнению с NKG2DL. Клетки AML, которые являются положительными для CD34, показывают более низкую поверхностную экспрессию NKG2DL, что указывает на то, что экспрессия NKG2DL связана с отсутствием стволовости.
Три первичных образца AML продемонстрировали 19,8, 49,8 и 89,4% положительных событий для окрашивания белка слияния по сравнению с 20,4, 50,4 и 90,6% для объединенного окрашивания антителом против NKG2DL. С другой стороны, окрашивание одним лигандом показало диапазон положительных событий до 92%, причем проценты варьировались в зависимости от лиганда. При попытке этого метода очень важно быть быстрым при размораживании первичных клеток AML, потому что они хрупкие и могут легко умереть на этом этапе.
После выполнения этого протокола можно выполнить сортировку клеток на основе сигнала NKG2DL для дальнейшего исследования популяций.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе представлены два различных метода окрашивания для выявления лигандов NKG2D (NKG2DLs) в первичных образцах острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) человека. Эти методы позволяют отделять лейкемические стволовые клетки от основной массы клеток ОМЛ для их дальнейшей характеристики.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Онкология
Теоретические основы
- Лиганды NKG2D имеют важное значение для иммунного распознавания при раке.
- Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) создает определенные трудности при характеристике клеток.
- Существующие методы могут быть недостаточно эффективны для дифференциации лейкозных стволовых клеток.
- Новые протоколы окрашивания позволяют расширить возможности детектирования.
Цель исследования
- Разработать эффективные протоколы окрашивания для детектирования NKG2DL.
- Облегчить отделение лейкемических стволовых клеток от общей популяции клеток при ОМЛ.
- Улучшить характеристику образцов при ОМЛ.
Используемые методы
- Использование химерного белка для распознавания NKG2DLs.
- Применение нескольких антител к NKG2DL.
- Размораживание и восстановление биотина и химерного белка NKG2D.
- Смешивание растворов для достижения необходимых концентраций для окрашивания.
Основные результаты
- Оба протокола эффективно выявляют известные и неизвестные NKG2DL.
- Достигнуто отделение лейкемических стволовых клеток от общей популяции клеток ОМЛ.
- Данные методы просты в использовании и позволяют быстро получить результат.
- Возможна расширенная характеристика клеток ОМЛ.
Выводы
- Новые протоколы окрашивания улучшают детекцию NKG2DL.
- Эти методы могут помочь в понимании биологии ОМЛ.
- Дальнейшие исследования могут опираться на эти методы для получения данных, имеющих терапевтическое значение.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Отличие лейкемических стволовых клеток от общей популяции клеток ОМЛ остается критически важной задачей при валидации мишеней и разработке доклинических моделей. Способность изолировать NKG2DL-отрицательные субпопуляции со свойствами стволовых клеток позволяет снизить механистические риски терапевтических гипотез и повысить прогностическую достоверность рабочих процессов на ранних этапах поиска. Такой подход напрямую помогает в приоритизации портфеля за счет выявления релевантных для заболевания систем с более высоким туморогенным потенциалом.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения лейкемических стволовых клеток на основе экспрессии NKG2DL на поверхности клеток.
- Практическая ценность: предоставляет быстрый и удобный метод дифференциации стволоподобных субпопуляций от дифференцированных клеток ОМЛ.
- Научная ценность: способствует биологическому снижению рисков посредством функциональной валидации свойств стволовых клеток в NKG2DL-отрицательных фракциях.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные данные проточной цитометрии для сравнения экспрессии NKG2DL при использовании подходов с окрашиванием на специфические лиганды и на все лиганды (pan-ligand staining).
- Практическая ценность: Предоставляет воспроизводимые стандартизированные протоколы окрашивания, совместимые с подготовкой к высокопроизводительному скринингу.
- Научная ценность: Обеспечивает подготовку валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений и исследований взаимодействия с мишенью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует согласованию трансляционных биомаркеров, связывая супрессию NKG2DL с механизмами ускользания от иммунного ответа в лейкозных стволовых клетках (LSCs).
- Практическая ценность: обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя изолировать клетки-инициаторы заболевания.
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность доклинических моделей за счет использования статуса NKG2DL для стратификации субпопуляций ОМЛ с различным туморигенным потенциалом.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений и доклинической оценки — обеспечивая возможность изоляции механистически определенных субпопуляций.
- Открывающая биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем отделения LSC, отрицательных по NKG2DL, от основной массы клеток AML, положительных по NKG2DL.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного количественного детектирования поверхностных маркеров, совместимого с платформами для скрининга на основе проточной цитометрии.
- Аналитика: Предоставляет количественные измерения зависимых переменных (процент положительных событий, интенсивность флуоресценции), что позволяет сравнивать методы окрашивания и частоту встречаемости субпопуляций.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями, позволяя изолировать LSC для функциональной валидации в моделях, релевантных данному заболеванию.
- Корпоративное повторное использование: Создает возможность многократного использования метода обогащения стволовыми клетками, применимую к образцам AML и адаптируемую к другим типам рака с аналогичными механизмами уклонения от иммунного ответа.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: прогностическая уверенность в обогащении стволовыми клетками, снижение механистической неопределенности при идентификации LSC.
- Операционная ценность: стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость детекции NKG2DL в нескольких образцах AML.
- Стратегическая ценность: улучшение принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) при валидации мишеней, эффективность использования капитала за счет раннего снижения рисков, уменьшение биологических рисков на поздних этапах.
- Влияние на портфель: приоритизация мишеней с поправкой на риск на основе потенциала обогащения LSC и фенотипа уклонения от иммунного ответа.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области проточной цитометрии, окрашивания клеток и работы с первичными образцами ОМЛ.
- Необходим доступ к проточным цитометрам, центрифугам и реагентам, включая биотин, слитый белок NKG2D, стрептавидин PE и 7-AAD.
- Для обеспечения воспроизводимости результатов необходима межгрупповая стандартизация стратегий гейтирования, FMO-контролей и настроек компенсации.
- При применении в различных модельных системах требуются корректировки в связи с вариабельностью паттернов экспрессии NKG2DL.
- Практические ограничения включают хрупкость первичных клеток ОМЛ при размораживании, что требует быстрой обработки для сохранения жизнеспособности.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Biotinylation of the NKG2D Fusion Protein and Thawing of Primary AML Cells
2:00
Staining of Primary AML Cells with the Biotinylated NKG2D Fusion Protein
3:24
Results: Gating Strategy and Staining Protocol Comparison
4:49
Conclusion
