Улучшенный протокол, эффективный по времени и труду, для выделения первичных гепатоцитов мышей
25 октября 2021 г.
Первичные гепатоциты являются ценным инструментом для изучения реакции печени и метаболизма in vitro. Используя коммерчески доступные реагенты, был разработан улучшенный протокол экономии времени и труда для выделения первичных гепатоцитов мышей.
Мышиные первичные гепатоциты играют важную роль в исследованиях печени. Особенно для метаболизма глюкозы и печеночного лекарственного тестирования. С точки зрения времени процесс изоляции может быть трудоемким, а энергия дорогостоящей.
Этот протокол может обеспечить эффективный способ выделения первичных гепатоцитов мыши. Это дружественно по времени и труду. Требуется очень мало шагов со всеми регионами, коммерчески доступными.
Начните с использования перистальтического насоса, чтобы начать откачку разогретой двойной дистиллированной воды со скоростью 4 мл в минуту, в течение пяти минут. Затем замените насосную трубку с воды на нагретую перфузионную среду. Мониторинг пузырьков воздуха между водой и перфузионной средой.
Поможет отследить протекание перфузионной среды через систему. Затем продезинфицируйте брюшко анестезированной восьминедельной C57 черной 6J женской мыши с 70% этанолом. И с помощью ножниц разрезайте брюшную полость, чтобы обнажить печень, воротную вену и нижнюю полую вену.
Затем остановите перистальтический насос. После убедитесь, что насосная трубка содержит перфузионную среду, а не воду. Вставьте катетер 24 калибра в нижнюю полую вену.
Снова включите насос и разрежьте портальную жилу. Пока перфузионная среда перекачивается, нажимайте на воротную вену каждую минуту, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени. Продолжайте откачку в течение примерно трех-пяти минут или до тех пор, пока смытая жидкость не станет прозрачной.
Затем замените насосную трубку с перфузионной среды на среду диспазы коллагеназы. И нажимайте на воротную вену каждую минуту, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени. Продолжайте сцеживание до тех пор, пока не истощатся все 25 мл среды диспазы коллагеназы.
Далее выделяют всю печень без желчного пузыря. И поместили его в 30 мл промывочной среды в чашку Петри на льду. С помощью щипцов разорвите печень на куски, чтобы выпустить первичные гепатоциты в раствор.
На этом этапе промывная среда превращается в мутный раствор, содержащий высвобожденные первичные гепатоциты и мелкие кусочки печени. Отфильтруйте этот мутный раствор через 70-микронный клеточный ситечко в 20 мл 1X на вызов HBSS в трубке объемом 50 мл на льду. И перемешать раствор, перевернув трубку 20 раз.
Далее центрифугируют раствор. Затем в тканевом культуральном капюшоне аспирируют супернатант. И промыть гранулу 30 мл холодной промывочной среды.
Гранулируйте клетки еще раз центрифугированием. Удалите надосадочное вещество и повторно суспендируйте гранулы в 25 мл питательной среды. Подсчитайте клетки и нанесите их на нужные культуральные пластины.
По опытному проекту. После обшивки изолированные первичные гепатоциты прочно прикреплялись на один час и полностью расширялись через 12 часов. В изолированных гепатоцитах уровни мРНК маркеров гепатоцитов, таких как транстиретин, CD95, ASGR1 и ASGR2, были значительно увеличены по сравнению со всей печенью.
Напротив, присутствие иммунных клеток, звездчатых клеток и эндотелиальных клеток было ниже. О чем свидетельствует резкое снижение уровня CD45, коллагена 1 типа альфа 1 и эндотелиальной клетки 2 киназы 2 мРНК. Предполагая, что этот протокол может значительно уменьшить помехи от других печеночных клеток.
После нанесения покрытий уровни ASGR1 и ASGR2 со временем снижались, но оставались сопоставимыми со всей печенью до 12-часовой временной точки. Особенно для ASGR1. Уровень экспрессии cd81, связанного с мембраной, был постоянным в течение 48 часов.
Для сравнения, экспрессия толл-подобного рецептора 4 обычно увеличивалась и становилась выше, чем уровни in vivo через 48 часов. Анализы чувствительности к инсулину показали, что инсулин значительно способствует фосфорилированию обоих АКТ при серине 473. И вилочная коробка 01 при серине 256, в гепатоцитах.
Указывает на чувствительность первичных гепатоцитов к инсулину. Уровень белка фосфоенолпируваткароксикиназы значительно повысился после лечения глюкагоном. Предполагая, что путь производства глюкозы был активирован.
Эта активация была дополнительно подтверждена увеличением производства глюкозы. И с другими стимуляторами производства глюкозы, такими как Forskolin + IBMX. Этот протокол может сэкономить как время, так и энергию для исследований с использованием мышиных первичных гепатоцитов.
Следуя этому протоколу, могут быть проведены связанные эксперименты, такие как гипотетический метаболизм глюкозы и фармацевтические анализы биомаркеров.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен трудо- и временем-затратный протокол выделения первичных гепатоцитов мыши, которые имеют решающее значение для изучения функций и метаболизма печени. В методе используются коммерчески доступные реагенты для повышения выхода клеток и минимизации влияния непаренхиматозных клеток.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Метаболизм в печени
- Метаболизм глюкозы
- Тестирование лекарственных препаратов
Теоретические основы
- Первичные гепатоциты мыши имеют важное значение для изучения биологии печени.
- Традиционные методы выделения часто требуют больших затрат времени и трудозатрат.
- Сокращение времени выделения может способствовать более эффективному проведению биологических экспериментов.
Используемые методы
- Протокол выделения с использованием перистальтического насоса и среды с коллагеназой и диспазой.
- Модель мыши: самки мышей линии C57BL/6J.
- Методы культивирования клеток и измерения экспрессии генов.
Основные результаты
- Повышенный уровень мРНК маркеров гепатоцитов по сравнению с цельной печенью.
- Снижение содержания иммунных и эндотелиальных клеток после изоляции.
- Продемонстрированная чувствительность к инсулину и активированные пути продукции глюкозы.
Выводы
- Данный протокол значительно повышает эффективность выделения первичных гепатоцитов.
- Углубленное понимание метаболизма глюкозы и лекарственного ответа в исследованиях печени.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эффективное выделение первичных гепатоцитов имеет решающее значение для исследований метаболизма печени и тестирования лекарственных препаратов, где временные и трудовые затраты влияют на пропускную способность рабочих процессов поиска новых соединений. Данный протокол сокращает время выделения примерно до 35 минут при сохранении выхода и чистоты гепатоцитов, что способствует быстрому тестированию гипотез в доклинических моделях. Этот метод позволяет масштабировать подготовку систем, релевантных конкретным заболеваниям, для механистического снижения рисков в процессах валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает получение очищенных гепатоцитов для проверки терапевтических гипотез в отношении метаболизма глюкозы и путей лекарственного ответа печени.
- Практическая ценность: сокращает временные и трудовые затраты, позволяя увеличить пропускную способность анализов по валидации мишеней.
- Прогностическая ценность: позволяет получить гепатоциты с доказанной чувствительностью к инсулину и активацией глюконеогенеза, что способствует снижению рисков при изучении механизмов действия мишеней в печени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать гепатоциты с низким уровнем примесей непаренхиматозных клеток, что повышает специфичность анализа при скрининге соединений.
- Практическая ценность: использование коммерчески доступных реагентов и стандартизированных этапов повышает воспроизводимость результатов в различных кампаниях по скринингу.
- Масштабируемость: обеспечивает подготовку валидированных биологических систем, подходящих для платформ высококонтентного или фенотипического скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: поддержка систем, имеющих значение для патологии, для доклинической валидации соединений, нацеленных на печень.
- Продвижение с учетом рисков: получение гепатоцитов с подтвержденным уровнем продукции глюкозы и инсулиновым ответом, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go).
- Соответствие биомаркеров: сохранение экспрессии маркеров гепатоцитов (ASGR1, ASGR2, CD81) на протяжении до 12 часов, что обеспечивает совместимость с анализами биомаркеров.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических исследований, обеспечивая надежный источник первичных гепатоцитов для анализов метаболизма в печени.
- Поиск новых биологических мишеней: позволяет проверять гипотезы о путях метаболизма в печени, обеспечивая получение гепатоцитов с подтвержденной экспрессией маркеров и функциональным ответом.
- Скрининг: позволяет получать гепатоциты, подходящие для оценки воздействия соединений, благодаря сниженному загрязнению стромальными клетками и стабильной чувствительности к инсулину.
- Аналитика: обеспечивает получение количественных данных, таких как уровень продукции глюкозы, результаты анализов на фосфорилирование и экспрессия мРНК маркеров гепатоцитов.
- Трансляционные исследования: связывает этап поиска мишеней с доклиническими работами, предоставляя гепатоциты, которые сохраняют ключевые метаболические функции на срок до 48 часов.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования метода изоляции, что стандартизирует подготовку гепатоцитов в различных проектах и исследовательских группах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов в исследованиях метаболизма печени за счет снижения клеточных помех и функциональной валидации.
- Операционная ценность: Оптимизирует рабочий процесс за счет минимизации количества этапов и использования коммерчески доступных реагентов, что повышает эффективность работы лаборатории.
- Стратегическая ценность: Ускоряет сроки проведения исследований, сокращая время изоляции с нескольких часов до ~35 минут, что позволяет увеличить частоту проведения анализов.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритезацию мишеней в печени с учетом рисков, предоставляя надежные доклинические модели для валидации механизмов.
Особенности реализации
- Требуется опыт проведения операций на мышах и выполнения процедур перфузии.
- Необходим доступ к перистальтическому насосу и стерильной среде для культивирования тканей.
- Требуется стандартизированная подготовка реагентов (перфузионная среда, коллагеназа-диспаза, промывочные и культуральные среды).
- При использовании линий мышей или возрастов, отличных от примененной модели самок C57BL/6J, может потребоваться адаптация методики.
- Ограничено необходимостью немедленного использования изолированных гепатоцитов для сохранения функциональной целостности, так как экспрессия маркеров снижается через 12 часов.
