Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс

Общая цель этой техники очистки состоит в том, чтобы разработать метод очистки тканей мозга крысы. Этот протокол также может быть использован для трансгенной крысы с ВИЧ-1. Основное преимущество этого метода заключается в том, что ткань мозга крысы может быть оставлена нетронутой для очистки, что позволяет проводить полный анализ на уровне цепи.

Демонстрировать процедуру будут Кристин Киршнер, кандидат наук из моей лаборатории, а также Хайлунг Ли, научный сотрудник из моей лаборатории. После проведения транскардиальной перфузии у крысы в возрасте от трех до шести недель удалите мозг из черепа с помощью щипцов. Затем поместите его в сагиттальное положение и разрежьте на четыре равных участка шириной три миллиметра с помощью лезвия бритвы и матрицы мозга крысы.

Закрепите каждую секцию в четырехпроцентной PFA в герметичной пятимиллилитровой пластиковой трубке на ночь на шейкере при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день продолжайте фиксацию при комнатной температуре в течение одного часа. Вымойте каждую секцию три раза с PBS в течение примерно 30 минут за одну стирку.

Промытые секции последовательно инкубируют в 20, 40, 60, 80 и 100% растворе метанола в течение одного часа каждая. Повторите обезвоживание со 100% метанолом. Затем охладите образцы в 100% метаноле при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Приготовьте раствор, содержащий 66% DCM и 33% метанола, и инкубируйте охлажденные участки в этом растворе в течение ночи при комнатной температуре с встряхиванием. На следующий день дважды промойте образец метанолом в течение 30 минут и охладите его в 100% метаноле при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Для отбеливания поместите образец в свежую пятипроцентную перекись водорода в метаноле и инкубируйте его в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

После ночной инкубации образец последовательно инкубируют в 80, 60, 40 и 20% растворах метанола в течение одного часа при комнатной температуре. Затем инкубируйте образец в PBS в течение одного часа и промойте его дважды в растворе, по одному в течение одного часа за промывку. Наполните одномиллилитровый шприц 2,5 микролитрами одного процента биотина-CTB и медленно вводите его в участок прилежащего ядра в течение 20 секунд.

Оставьте кончик иглы на месте на одну минуту и медленно снимите его в течение 10 секунд, чтобы предотвратить утечку. Инкубируйте образец в третьем растворе, а затем в четвертом растворе в течение двух дней каждый на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Затем добавьте первичное антитело и продолжайте инкубацию в течение семи дней.

Промойте образец пять раз в растворе два в течение одного часа за промывку и храните его в растворе два при комнатной температуре в течение ночи. Инкубируйте образец со вторичным антителом в течение семи дней на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Наконец, промойте его пять раз в растворе два в течение одного часа за промывку и храните в растворе два при комнатной температуре в течение ночи при слабом освещении.

Инкубируйте образец последовательно в 20, 40, 60, 80 и 100% метаноле в течение одного часа при комнатной температуре. Затем инкубируйте его в свежем 100% метаноле на ночь. На следующий день инкубируйте образец в свежеприготовленном 66% DCM в 33% метаноле в течение трех часов при комнатной температуре с встряхиванием.

Через три часа инкубируйте образец в дибензиловом эфире, не встряхивая, до тех пор, пока он не станет прозрачным. Затем храните его в дибензиловом эфире до проведения визуализации. Приобретите камеру для 3D-принтера и закрепите ее на предметном стекле микроскопа с помощью эпоксидной смолы.

Поместите образец в квадратное пространство в центре камеры и полностью заполните камеру дибензиловым эфиром. Наденьте на камеру защитный колпак толщиной 0,17 мм и надавите, чтобы убедиться, что он полностью соприкасается со стенками камеры. Затем заклейте края с помощью эпоксидной смолы.

Обязательно вращайте камеру, чтобы пузырьки воздуха могли выйти из заправочного отверстия. Заполните камеру дополнительным количеством дибензилового эфира. Затем запечатайте заливное отверстие эпоксидной смолой и дайте ему застыть.

Рассмотрите образец с помощью системы конфокального микроскопа, чтобы выполнить z-сканирование с четырехкратным увеличением. Конфокальное изображение гидрофобно очищенного образца ткани при четырехкратном увеличении показывает плотное окрашивание TH в области черной субстанции, редкие нейроны TH, прилегающие к черной субстанции, и темно-черную область ткани, в которой отсутствуют нейроны TH. Типичная морфология ТГ-положительного нейрона при 20-кратном увеличении имеет большую сому и несколько ветвящихся отростков.

В то время как окрашенная IBA1 микроглия имеет мелкие клеточные тела и более короткие процессы расширения. Идеальное конфокальное изображение показывает положительное и плотное окрашивание TH в области черной субстанции с подходящим усилением флуоресценции. Примеры плохих конфокальных изображений включают неправильно сфокусированное изображение со слишком большим флуоресцентным усилением, ложноположительное окрашивание яркими пятнами, не сфокусированными с остальной тканью, и сильное фоновое окрашивание в результате использования блокирующей сыворотки, которая не совпадает с вторичным антителом.

Здесь показано положительное окрашивание СТБ в мозге крысы. Длинные тонкие волокна представляют собой афферентные выступы вдоль дофаминергического пути. Колокализация ТГ и СТБ позволяет визуализировать место инъекции в области прилежащего ядра, которое выглядит в виде плотно флуоресцентного зеленого круга.

Показана колокализация ТГ и СТБ в черной субстанции. Самое важное, о чем следует помнить при попытке проведения этой процедуры, — это дать образцу достаточно времени для инкубации во всех растворах антител и достаточно времени для полного очищения перед визуализацией. Образец должен находиться в ограниченном контакте с воздухом, так как это может повредить образец.

Этот метод очень универсален и может быть использован для исследования множества различных белков, представляющих интерес в различных областях мозга. Данная методика помогает проложить путь нейробиологам к исследованию мозга крысы на уровне цепи, что имеет важное значение для изучения мозга как целостной системы.