Точечная вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия для анализа молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток

Современное представление о латеральной организации плазматической мембраны остается неполным. По этой причине важно внедрить некоторые новые инновационные методы, такие как спектроскопия флуоресцентной корреляции с вариациями пятен. Это очень мощная методика, характеризующаяся отличным временным и пространственным разрешением.

Кроме того, он является неинвазивным и позволяет изучать клеточные мембраны в физиологических условиях. Каждый день перед проведением эксперимента открывайте все диафрагмы радужной оболочки и используйте измеритель мощности для измерения мощности лазера при полностью открытой первой диафрагме. Поверните пластину наполовину, чтобы найти максимальную мощность.

Если мощность лазера ниже обычной, используйте диафрагмы для проверки юстировки и поочередно перемещайте L1 и M1 по мере необходимости. Затем запишите значение мощности в лабораторном блокноте. Чтобы проверить путь обнаружения, поместите на объектив воду, защитный стекло и каплю двух наномолярных растворов родамина 6G.

Затем запустите программное обеспечение коррелятора и запишите данные. Функция автоматической корреляции должна отображать низкое количество шума, небольшой размер отходов и высокую скорость подсчета на молекулу в секунду. Чтобы откалибровать размер пятна, поместите закодированное клеточной культурой покровное стекло на объектив для погружения в воду и добавьте 200 микролитров двух наномолярных растворов родамина 6G в покровное стекло.

Отрегулируйте мощность лазерного луча 488 нанометров до 300 микроватт и в программном обеспечении выберите порт микроскопа для обнаружения освещения svFCS. Включите APD и открывайте диафрагму до тех пор, пока сигнал не упадет, чтобы получить минимальный размер отходов, или закройте его для большего размера отходов. Запишите около 10, 20 секунд функций автоматической корреляции для улучшения статистической воспроизводимости и отключения APD.

В соответствующей программе анализа данных проверьте и отбросьте прогоны с сильными колебаниями, вызванными молекулярными агрегатами, затем сопоставьте среднее значение сохраненной функции автоматической корреляции с 3D-моделью диффузии, извлеките среднее время диффузии из параметров подгонки и сохраните данные в виде файла TXT. Для анализа svFCS отрегулируйте луч длиной 488 нанометров в диапазоне от двух до четырех микроватт и уравновесьте образцы в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Выберите порт микроскопа обнаружения освещенности svFCS и на APD.

Затем выполните сканирование по оси XY и сканирование по оси Z выбранной ячейки. Выберите плазматическую мембрану в верхней части клетки, чтобы определить местоположение конфокального пятна с максимальной интенсивностью флуоресценции и начать сбор данных. В программном обеспечении коррелятора запишите одну серию из 20 пятисекундных прогонов.

После последнего запуска выключите APD и откажитесь от всех неожиданных запусков, как показано на рисунке. Подгоните среднюю функцию автоматической корреляции к двухвидовой 2D-модели диффузии и сохраните параметры подгонки в ранее сохраненный файл TXT. Когда все интересующие клетки будут зарегистрированы, проанализируйте по крайней мере четыре размера отходов в диапазоне от 200 до 400 нанометров, чтобы установить единый закон диффузии.

Затем в MATLAB выберите папку, содержащую все файлы TXT, соответствующие как минимум четырем экспериментам по размеру отходов, и построите график времени диффузии в зависимости от квадрата отходов. На этом рисунке можно наблюдать закон диффузии для Thy1-GFP, экспрессируемого в клетках Cos7. Закон диффузии имеет положительное значение времени ноль, указывающее на то, что Thy1-GFP ограничен нанодоменными структурами плазматической мембраны.

В этом анализе обработка холестериноксидазой клеток, экспрессирующих Thy1-GFP, привела к смещению нулевого значения закона диффузии до 7,36 плюс-минус 1,34 миллисекунды. Подтверждение того, что характер конфайнмента Thy1-GFP зависит от содержания холестерина и связан с нанодоменами липидного рафта. Небольшое, но достоверное снижение содержания общего холестерина наблюдалось и при лечении холестериноксидазой.

Поскольку этот фермент действует только на пул холестерина, доступный у наружной створки плазматической мембраны, эти данные позволяют предположить, что наблюдаемое снижение уровня холестерина связано только с плазматической мембраной и вызывает дестабилизацию нанодоменов липидного рафта. Самым важным при попытке проведения этой процедуры является правильная калибровка системы svFCS и подготовка клеток к анализу. svFCS является отличным инструментом для изучения организации клеточных мембран

Тем не менее, его также можно использовать для анализа диффузии внутриклеточных молекул. Этот метод может быть успешно реализован в биомедицине для определения влияния потенциальных лекарств на живые клетки, такие как раковые клетки.