Точечная вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия для анализа молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток
12 ноября 2020 г.
Целью этой статьи является представление протокола о том, как построить микроскоп точечной флуоресцентной корреляционной спектроскопии (svFCS) для измерения молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток.
Современное представление о латеральной организации плазматической мембраны остается неполным. По этой причине важно внедрить некоторые новые инновационные методы, такие как спектроскопия флуоресцентной корреляции с вариациями пятен. Это очень мощная методика, характеризующаяся отличным временным и пространственным разрешением.
Кроме того, он является неинвазивным и позволяет изучать клеточные мембраны в физиологических условиях. Каждый день перед проведением эксперимента открывайте все диафрагмы радужной оболочки и используйте измеритель мощности для измерения мощности лазера при полностью открытой первой диафрагме. Поверните пластину наполовину, чтобы найти максимальную мощность.
Если мощность лазера ниже обычной, используйте диафрагмы для проверки юстировки и поочередно перемещайте L1 и M1 по мере необходимости. Затем запишите значение мощности в лабораторном блокноте. Чтобы проверить путь обнаружения, поместите на объектив воду, защитный стекло и каплю двух наномолярных растворов родамина 6G.
Затем запустите программное обеспечение коррелятора и запишите данные. Функция автоматической корреляции должна отображать низкое количество шума, небольшой размер отходов и высокую скорость подсчета на молекулу в секунду. Чтобы откалибровать размер пятна, поместите закодированное клеточной культурой покровное стекло на объектив для погружения в воду и добавьте 200 микролитров двух наномолярных растворов родамина 6G в покровное стекло.
Отрегулируйте мощность лазерного луча 488 нанометров до 300 микроватт и в программном обеспечении выберите порт микроскопа для обнаружения освещения svFCS. Включите APD и открывайте диафрагму до тех пор, пока сигнал не упадет, чтобы получить минимальный размер отходов, или закройте его для большего размера отходов. Запишите около 10, 20 секунд функций автоматической корреляции для улучшения статистической воспроизводимости и отключения APD.
В соответствующей программе анализа данных проверьте и отбросьте прогоны с сильными колебаниями, вызванными молекулярными агрегатами, затем сопоставьте среднее значение сохраненной функции автоматической корреляции с 3D-моделью диффузии, извлеките среднее время диффузии из параметров подгонки и сохраните данные в виде файла TXT. Для анализа svFCS отрегулируйте луч длиной 488 нанометров в диапазоне от двух до четырех микроватт и уравновесьте образцы в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Выберите порт микроскопа обнаружения освещенности svFCS и на APD.
Затем выполните сканирование по оси XY и сканирование по оси Z выбранной ячейки. Выберите плазматическую мембрану в верхней части клетки, чтобы определить местоположение конфокального пятна с максимальной интенсивностью флуоресценции и начать сбор данных. В программном обеспечении коррелятора запишите одну серию из 20 пятисекундных прогонов.
После последнего запуска выключите APD и откажитесь от всех неожиданных запусков, как показано на рисунке. Подгоните среднюю функцию автоматической корреляции к двухвидовой 2D-модели диффузии и сохраните параметры подгонки в ранее сохраненный файл TXT. Когда все интересующие клетки будут зарегистрированы, проанализируйте по крайней мере четыре размера отходов в диапазоне от 200 до 400 нанометров, чтобы установить единый закон диффузии.
Затем в MATLAB выберите папку, содержащую все файлы TXT, соответствующие как минимум четырем экспериментам по размеру отходов, и построите график времени диффузии в зависимости от квадрата отходов. На этом рисунке можно наблюдать закон диффузии для Thy1-GFP, экспрессируемого в клетках Cos7. Закон диффузии имеет положительное значение времени ноль, указывающее на то, что Thy1-GFP ограничен нанодоменными структурами плазматической мембраны.
В этом анализе обработка холестериноксидазой клеток, экспрессирующих Thy1-GFP, привела к смещению нулевого значения закона диффузии до 7,36 плюс-минус 1,34 миллисекунды. Подтверждение того, что характер конфайнмента Thy1-GFP зависит от содержания холестерина и связан с нанодоменами липидного рафта. Небольшое, но достоверное снижение содержания общего холестерина наблюдалось и при лечении холестериноксидазой.
Поскольку этот фермент действует только на пул холестерина, доступный у наружной створки плазматической мембраны, эти данные позволяют предположить, что наблюдаемое снижение уровня холестерина связано только с плазматической мембраной и вызывает дестабилизацию нанодоменов липидного рафта. Самым важным при попытке проведения этой процедуры является правильная калибровка системы svFCS и подготовка клеток к анализу. svFCS является отличным инструментом для изучения организации клеточных мембран
.Тем не менее, его также можно использовать для анализа диффузии внутриклеточных молекул. Этот метод может быть успешно реализован в биомедицине для определения влияния потенциальных лекарств на живые клетки, такие как раковые клетки.
Обзор
В данной статье представлен протокол сборки микроскопа для флуоресцентной корреляционной спектроскопии с вариацией пятна (svFCS), предназначенного для измерения молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток. Данный метод обеспечивает отличное временное и пространственное разрешение, оставаясь при этом неинвазивным.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Флуоресцентная микроскопия
Теоретическая часть
- Латеральная организация плазматической мембраны изучена не полностью.
- Для более глубокого понимания необходимы инновационные методы, такие как svFCS.
- Метод svFCS позволяет изучать клеточные мембраны в физиологических условиях.
- Для получения точных результатов критически важны правильная калибровка и подготовка клеток.
Цель исследования
- Разработать протокол для микроскопии svFCS.
- Измерить молекулярную диффузию на плазматической мембране.
- Проанализировать влияние холестерина на организацию мембраны.
Используемые методы
- Калибровка системы svFCS с использованием раствора родамина 6G.
- Сбор данных путем XY- и Z-сканирования выбранных клеток.
- Анализ законов диффузии с помощью MATLAB.
- Сравнение параметров диффузии до и после обработки холестеролоксидазой.
Основные результаты
- Диффузия Thy1-GFP ограничена нанодоменными структурами.
- Обработка холестеролоксидазой смещает значение закона диффузии при нулевом времени.
- Наблюдалось снижение общего содержания холестерина.
- Результаты исследования позволяют предположить, что холестерин влияет на стабильность липидных рафтов.
Выводы
- Метод svFCS эффективен для изучения организации клеточной мембраны.
- Данная методика также позволяет анализировать диффузию внутриклеточных молекул.
- Полученные результаты имеют важное значение для понимания воздействия лекарственных препаратов на живые клетки.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия с вариацией пятна (svFCS) позволяет проводить анализ молекулярной диффузии на плазматической мембране с высоким разрешением в физиологических условиях, что дает критически важную информацию об организации мембраны и динамике липидных рафтов. Эта возможность способствует валидации мишеней за счет выяснения биофизического контекста мембранно-ассоциированных белков, что помогает снизить механистические риски на ранних этапах поиска лекарственных средств. Неинвазивный характер метода и его совместимость с живыми клетками повышают его полезность при доклиническом скрининге и трансляционных исследованиях биомаркеров.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Проверка терапевтических гипотез путем количественного анализа диффузионного поведения мембранных белков, таких как Thy1-GFP, внутри структур нанодоменов.
- Операционная ценность: Выявление холестерин-зависимого ограничения подвижности, что позволяет функционально подтвердить ассоциацию с липидными рафтами.
- Прогностическая ценность: Оптимизация отбора перспективных мишеней путем идентификации белков, мембранная локализация которых чувствительна к изменениям липидного окружения.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для скрининга соединений путем установления базовых законов диффузии в физиологических условиях.
- Количественные данные: Получение воспроизводимых измерений времени диффузии при различных размерах перетяжки пучка, что способствует стандартизации анализа.
- Значимость для скрининга: Обнаружение индуцированных соединениями сдвигов параметров диффузии, указывающих на изменения в организации мембран или взаимодействие с мишенью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для заболеваний: Моделирует нарушение нанодоменов липидных рафтов плазматической мембраны, что актуально для патологий, связанных с дисрегуляцией липидного обмена.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты ранних поисковых исследований с доклинической валидацией, демонстрируя, как изменения условий среды (например, модуляция уровня холестерина) влияют на поведение мишени.
- Принятие решений с учетом рисков: Обеспечивает получение механистических данных, которые позволяют определить критерии принятия решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на основе устойчивости мишени к воздействиям на мембрану.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Метод svFCS вписывается в континуум открытий — от проверки гипотез относительно мишени и идентификации ведущих соединений до доклинической валидации, предлагая биофизический уровень характеризации, который дополняет биохимические и фенотипические анализы.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез путем измерения коэффициентов диффузии и идентификации ограниченных и мобильных популяций молекул.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной калибровки с использованием родамина 6G и проверки целостности пути детектирования.
- Аналитика: Позволяет получить количественные законы диффузии с помощью анализа функций автокорреляции в MATLAB, что дает возможность сравнивать поведение молекул при различных условиях.
- Трансляционные исследования: Связывает изменения в организации мембран с функциональными результатами, способствуя определению биомаркеров в тех случаях, когда сдвиги диффузии коррелируют с фенотипическими ответами.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократно используемую платформу для изучения динамики мембранных белков для различных мишеней и клеточных линий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет разрешения наноразмерного ограничения и гетерогенности диффузии на плазматической мембране.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированной калибровке мощности лазера, проверке путей детектирования и усреднению повторных функций автокорреляции.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет количественной оценки стабильности мишени в мембранных средах, близких к нативным, что снижает вероятность неудач на поздних стадиях из-за непредвиденных биофизических факторов.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе их зависимости от целостности липидных рафтов для правильной локализации и функционирования.
Особенности реализации
- Требуется экспертный опыт в области флуоресцентной микроскопии, лазерной безопасности и анализа данных корреляционной спектроскопии.
- Необходим модифицированный флуоресцентный микроскоп с лавинным фотодиодом (APD), программным обеспечением коррелятора и системой точного контроля мощности лазера (2–4 µW для измерений svFCS).
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов калибровки (например, валидация размера пятна rhodamine 6G) и конвейеров анализа данных (например, аппроксимация 2D-моделей диффузии в MATLAB).
- Необходимо учитывать особенности адаптации метода для различных мембранных белков, типов клеток и агентов воздействия, помимо холестеролоксидазы.
- Ограничено необходимостью тщательной подготовки образцов для предотвращения образования молекулярных агрегатов и обеспечения физиологической релевантности в процессе уравновешивания при 37°C.
