Очистка Тубулина с контролируемыми посттрансляционными модификациями и изотипами из ограниченных источников по циклам полимеризации-деполимеризации

Этот метод позволяет получать чистый пригодный для сборки тубулин с определенными посттрансляционными модификациями в количествах, достаточных для проведения целых наборов экспериментов in vitro. Этот протокол, основанный на циклах полимеризации и деполимеризации тубулина, легко выполнить в любой лаборатории клеточной биологии. Это позволяет производить большое количество тубулина за очень короткое время работы.

Чтобы очистить тубулин от суспензионных культур, за девять дней до приготовления тубулина оживите и амплифицируйте нужный тип клеток до получения шести сливающихся 15-сантиметровых чашек. За восемь дней до подготовки тубулина добавьте по одному литру предварительно подогретой среды в каждую бутылку для спиннера в каждой чашке под шкафом для клеточных культур и поместите спиннеры на стол для перемешивания внутри инкубатора для клеточных культур. Оставьте боковые крышки спиннера слегка открытыми, чтобы среда могла уравновеситься в атмосфере инкубатора.

На следующий день используйте клетки из сливающихся посуд, чтобы привить вращающиеся бутылки. Верните вращающиеся бутылки в инкубатор на одну неделю с приоткрытыми боковыми клапанами. Чтобы собрать клетки, переложите культуры из вращающихся бутылок в литровые центрифуги и соберите клетки методом центрифугирования.

Ресуспендируйте каждую гранулу в 10 миллилитрах ледяного PBS и объедините ресуспензионные элементы в 50-миллилитровую пробирку для центрифугирования при четырех градусах Цельсия. Для 10-миллилитровой клеточной гранулы добавьте в гранулу 10 миллилитров лизисного буфера и несколько раз переверните трубку, чтобы повторно суспендировать клетки. Для очистки тубулина от адгезивных клеточных культур оживите и амплифицируйте нужный тип клеток до получения 10 сливающихся 15-сантиметровых посудин в день подготовки тубулина.

Чтобы собрать адгезивные клетки, обрабатывая три чашки за раз, наклоните чашки для культивирования, чтобы удалить среду, в то время как второй человек осторожно промывает клетки семью миллилитрами PBS-EDTA. После мытья второй человек должен обработать клетки пятью миллилитрами PBS-EDTA на каждую чашку, прежде чем третий человек должен использовать клеточный подъемник, чтобы аккуратно прижать клетки к одному краю чашки. Когда клетки будут отделены, соберите клетки из всех трех чашек в 50-миллилитровую пробирку со льдом и промойте каждую пластину еще двумя миллилитрами PBS-EDTA, чтобы собрать все оставшиеся клетки.

После сбора клеток методом центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость для определения объема клеточной гранулы. Добавьте буфер для лизиса, повторно суспензируйте клетки и переложите их в пробирку с круглым дном объемом 14 миллилитров. Ультразвуковая обработка ячеек в течение примерно 45 импульсов.

Для лизиса мозга мыши добавьте 500 микролитров лицензированного буфера в один мозг, собранный у взрослой мыши, и используйте блендер для лизирования ткани. После получения лизата на 1/100 его объема до равного объема в 2 раза увеличить буфер Леммли и кипятить раствор в течение пяти минут. Храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия до количественного определения.

Собирайте образец таким образом на каждом этапе подготовки тубулина. Чтобы осветлить лизат, центрифугируйте образец и с помощью длинной иглы осторожно перенесите прозрачную надосадочную жидкость в новую пробирку, стараясь избегать верхнего плавающего слоя. После осветления лизата необходимо удалить плавающий материал из надосадочной жидкости, в противном случае это может негативно сказаться на эффективности очистки тубулина.

Чтобы полимеризовать тубулин из осветленного лизата, смешайте весь объем надосадочной жидкости с 1/200 объема 0,2 молярного ГТФ и половиной объема теплого глицерина в пробирке соответствующего размера. Аккуратно пипетируйте смесь, следите за тем, чтобы не попадание пузырьков воздуха. Заклейте трубки парапленкой и поместите их на водяную баню при температуре 30 градусов Цельсия на 20 минут.

После центрифугирования перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку. Для деполимеризации микротрубочек, присутствующих в грануле два, повторно суспендируйте гранулу в ледяной BRB 80 на пять минут на льду. Пипетируйте образец сначала с помощью пипетки P1000, затем с помощью пипетки P200 каждые пять минут в течение 20 минут на льду.

Как только образец станет однородным, его центрифугируют и переносят полученную надосадочную жидкость в новую пробирку. Чтобы удалить из тубулина ассоциированные с микротрубочками белки, смешайте весь объем надосадочной жидкости три с равным объемом предварительно нагретой одной молярной трубки S, таким же объемом предварительно нагретого глицерина и 1/100 объема 0,2 моляра ГТФ. Перед центрифугированием смесь инкубируйте в течение 20 минут при температуре 30 градусов Цельсия.

Переложите ассоциированный с микротрубочками белоксодержащий надосадочный слой четыре в новую пробирку, гранула содержит полимеризованные микротрубочки. После выполнения третьей полимеризации и деполимеризации количество собранного тубулина может быть количественно определено с помощью страничного анализа SDS. Успех процесса очистки можно подтвердить на странице Кумасси, окрашенной в паспорт безопасности.

Более низкий, чем ожидалось, выход очищенного тубулина может быть обусловлен неэффективной полимеризацией тубулина, о чем свидетельствует меньшее количество тубулина во второй, четвертой и шестой фракциях гранул и большее количество во второй, четвертой и шестой фракциях надосадочной жидкости. Для количественного определения очищенного тубулина образцы можно провести рядом с известными количествами бычьего сывороточного альбумина. Количественная денситометрия белковых полос позволяет рассчитать количество очищенного тубулина.

Статус модификации тубулина может быть подтвержден иммуноблоттингом образцов. Наш протокол позволяет выделять тубулин с помощью контролируемых посттрансляционных модификаций. С помощью этого тубулина мы можем проводить эксперименты по восстановлению in vitro, которые позволяют определить влияние модификаций тубулина на свойства микротруб, а также на их взаимодействие с белками, связанными с микротрубочками.