Кормление и количественная оценка крови и искусственного питания животных у комаров Aedes aegypti

Этот метод позволяет исследователям кормить и самостоятельно выполнять высокопроизводительные измерения для сравнения объемов пищи, потребляемой сотнями отдельных комаров. Он может быть адаптивным для изменения содержимого пищи или для сравнения объема, потребляемого различными экспериментальными группами. Этот протокол призван быть удобным для пользователя и недорогим.

Для фармакологических и генетических манипуляций, изучения кормления комаров кровью и пищевого поведения после наводнения. Организация имеет решающее значение для этого протокола. Подготовьте установку и реагенты заранее, чтобы вы могли быстро доставить еду комарам.

Для начала перелейте от 1,98 до двух миллилитров дефибринированной овечьей крови в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. При проведении флуоресцентного количественного определения размера пищи добавьте раствор флуоресцеина до конечной концентрации 0,002%, уменьшая объем крови на ту же величину, что и добавленный флуоресцеин. Оставьте один миллилитр рецептуры конечного приема пищи для создания эталонной стандартной кривой.

Все блюда и растворы, содержащие флуоресцеин, следует заворачивать в алюминиевую фольгу или хранить в темноте. Для приготовления безбелковых соленых блюд смешайте 600 микролитров 400 миллимолярного бикарбоната натрия с 1,39 миллилитрами двойной дистиллированной воды в конической трубке объемом 15 миллилитров. Если впоследствии необходимо провести количественное определение размера муки на основе флуоресценции, добавьте раствор флуоресцеина до конечной концентрации 0,002%, уменьшив объем воды на ту же величину, что и добавленный флуоресцеин.

Оставьте не менее одного миллилитра готовой рецептуры, содержащей 0,002% флуоресцеина, для получения эталонной стандартной кривой. Отложите приготовленные блюда до тех пор, пока не будете готовы их доставить. Все блюда и растворы, содержащие флуоресцеин, следует заворачивать в алюминиевую фольгу или хранить в темноте.

Поместите опытную группу самок комаров в емкость и накройте их сеткой. Дайте этим самкам акклиматизироваться в камере кормления. Откажитесь от контрольной группы некормленных комаров, которым не будет предлагаться еда.

Чтобы построить трубку GLI, заполните коническую трубку объемом 50 миллилитров 40 миллилитров 100% глицерина. Закройте открытую коническую трубку двумя кусками парапленки, чтобы свести к минимуму вероятность утечки. По желанию удерживайте парапленку на месте с помощью резинок.

Переверните трубку, чтобы убедиться, что в ней нет отверстий или зазоров. Чтобы создать устройство доставки еды, вырежьте центрированное отверстие длиной 2,5 см в завинчивающейся крышке конической трубки с помощью острого лезвия бритвы или лаве. Растяните кусок парапленки равномерно, чтобы он увеличился примерно в два раза.

Парапленка должна быть достаточно тонкой, чтобы через нее могли легко проколоться комары, но при этом не должно быть протечек. Заклейте внешнюю поверхность завинчивающейся крышки парапленкой, чтобы полностью закрыть отверстие, и отложите крышку в сторону. Нагрейте герметичную трубку с глицерином, кровью и солевыми растворами и водяную баню при температуре от 42 до 45 градусов Цельсия в течение не менее 15 минут.

Добавьте АТФ в подогретую еду и тщательно перемешайте. Пипеткой внесите два миллилитра подогретого блюда во внутреннюю камеру завинчивающейся крышки и аккуратно поместите на нее перевернутую подогретую коническую трубку, наполненную глицерином. Частично закрутите крышку с мукой на наполненную глицерином трубку, ровно настолько, чтобы предотвратить утечку еды или глицерина.

Поместите собранную трубку на верхнюю часть контейнера для комаров, нанесите углекислый газ и дайте комарам доступ к корму не менее 15 минут, чтобы достичь максимальной нормы кормления. После кормления крышку пробирки GLI можно выбросить как биологически опасные отходы или использовать повторно после замачивания в растворе отбеливателя с низким процентом и тщательной промывки в воде. Чтобы построить эталонную стандартную кривую, приготовьте серийное разведение той же муки, содержащей 0,002% флуоресцеина, которая была предложена экспериментальной группе комаров.

Чтобы сделать первое решение стандартной кривой, добавьте 50 микролитров шрота, содержащего 0,002% флуоресцеина, к 950 микролитрам PBS и тщательно перемешайте. Выполняйте двукратное разведение для остальных стандартных кривых растворов, совершая вихревые разведения задолго до каждого разведения. Пипеткой внесите по 100 микролитров каждого из стандартных кривых растворов в каждую из восьми лунок в первой колонке 96-луночного ПЦР-планшета.

Добавьте по одному обезболиваемому или замороженному некормленному контрольному комару в каждую из тех же восьми лунок. Повторите во втором столбце таблички для повторного измерения. Добавьте по 100 микролитров PBS в каждую оставшуюся лунку для некормленной контрольной и опытной групп.

В качестве отрицательного контроля добавьте по одному некормленному комару в каждую лунку в следующих двух столбцах пластины. Добавьте по одному комару в лунку к оставшимся лункам из опытных групп, которым предложили поесть. Добавьте в каждую лунку трехмиллиметровые шарики боросиликатного твердого стекла, если они разрушают ткань гомогенизатором бисерной мельницы.

Осторожно запечатайте планшет и разрушьте ткань, затем центрифугируйте планшет со скоростью 2000 об/мин в течение одной-двух минут, чтобы собрать лизат. Приготовьте черную 96-луночную пластину со 180 микролитрами PBS в каждой лунке. Затем добавьте по 20 микролитров лизата в каждую лунку и перемешайте.

Измерьте интенсивность флуоресцеина с помощью планшетного считывателя с каналами возбуждения 485 и каналами излучения 520. Постройте эталонную стандартную кривую, построив график известного объема приема пищи относительно соответствующего измерения интенсивности флуоресценции. Используя полученную эталонную стандартную кривую, экстраполируйте объем пищи, проглоченный каждым из комаров экспериментальной группы.

Вычтите среднее значение интенсивности флуоресценции в контрольной группе, не получавшей питания, из показателя интенсивности флуоресценции каждого индивидуума экспериментальной группы, чтобы сделать поправку на исходный уровень автофлуоресценции тканей. Для измерения размера флуоресцеиновой муки в эксперименте по кормлению кровью была построена стандартная кривая путем построения графиков показаний флуоресценции из назначенных эталонных колодцев, содержащих некормленного комара и известный объем муки с 0,002% флуоресцеина. Показания флуоресценции из остальных колодцев, в которых содержатся комары либо из некормленной контрольной группы комаров, либо из экспериментальной группы комаров, которым предложили пищу, сравниваются с этой стандартной кривой для количественной оценки объема потребляемой пищи.

Хотя всем самкам в экспериментальной группе предлагали кровяную пищу, некоторых комаров кормили, а некоторых нет. Этот протокол может быть использован для доставки и количественного определения блюд с различными белковыми составами. Данные, собранные с использованием пищи с добавлением фтора, приведены здесь.

Также был проведен независимый эксперимент, в котором комары оценивались как накормленные или некормленные на глаз после того, как им предлагали пищу без фтора. Этот протокол был использован для определения потребляемого объема пищи с препаратами, регулирующими поведение комаров-хозяев. В этих экспериментах женщинам предлагали физиологический раствор и АТФ-пищу с агонистом двух рецепторов NPY человека.

Этот метод также использовался для измерения поведения кормления нектаром путем замены трубки на ватный шарик, пропитанный 10% сахарозы, содержащей 0,002% флуоресцеина, демонстрируя, что он может быть использован для измерения меньших или более переменных размеров пищи, которые не могут быть точно различимы при групповых измерениях веса. Наиболее важным моментом при выполнении этого протокола является организация образцов в события и выделение некормленных комаров и одного мл каждого приема пищи для создания стандартной кривой. После этой процедуры можно наблюдать за поведением животных после кормления кровью и отслеживать пищеварение.

Этот метод позволяет исследователям оценить изменения в потреблении пищи генетически модифицированными комарами. Он также обеспечивает прямой, быстрый и неинвазивный способ доставки лекарств комарам и проверки их влияния на поведение.