ПЦР-мутагенез, клонирование, экспрессия, протоколы быстрой очистки белка и кристаллизация дикого типа и мутантных форм триптофанссинтазы

Этот протокол очистки фермента триптофансинтазы от Salmonella typhimurium быстрый, простой и короткий. Фракционирование сульфата аммиака и эксклюзионная хроматография позволяют очистить комплекс триптофансинтазы дикого типа и мутантного типа за один день. Этот метод может быть применен для очистки других родственных белков, поскольку фракционирование сульфата аммиака и эксклюзионная хроматография обычно используются для очистки немеченых белков.

Для начала разрушьте клеточную гранулу с помощью ультразвуковой обработки на ледяной водяной бане с амплитудой 80% в течение 20 циклов, используя 10-секундные импульсы и 20-секундные паузы. Центрифугируйте лизат клеток при 30 000 умноженных на g в течение 30 минут при 25 градусах Цельсия и аспирируйте надосадочную жидкость, не вытесняя гранулу. Осветленную фракцию надосадочной жидкости отфильтровать фильтром 0,45 микрометра при комнатной температуре.

Медленно добавляйте в фильтрат небольшое количество сульфата аммония до достижения 20% насыщения. Проведите фракционирование сульфата аммония при температуре 25 градусов Цельсия и аккуратно помешивайте раствор в течение 10 минут, стараясь не допустить образования пузырьков. Снова центрифугируйте раствор в течение 10 минут, и переложите надосадочную жидкость в чистую колбу для дальнейшего использования.

Аккуратно суспендируйте гранулу в 20 миллилитрах буфера для образца и подготовьте образец для запуска SDS-PAGE. Добавляйте сульфат аммония в надосадочную жидкость до достижения 30% насыщения, и перемешивайте раствор, не допуская образования пузырьков. Снова центрифугируйте раствор в течение 10 минут, и переложите надосадочную жидкость в чистую колбу для дальнейшего использования.

Аккуратно ресуспендируйте полученную 40%-ную фракцию гранул в 10 миллилитрах образца буфера два, и подготовьте образец к запуску SDS-PAGE. Затем провести микроцентрифугирование образца с 40%-ным белком при 10 000-кратном g в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия и загрузить полученную надосадочную жидкость на предварительно уравновешенную колонку HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR, прикрепленную к прибору для быстрой жидкостной хроматографии белка со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту. Оцените собранные пиковые фракции и фракции сульфата аммония на 12%-ном геле SDS-PAGE, окрашенном бриллиантовым синим цветом Coomassie.

Концентрируйте комплекс триптофансинтазы дикого типа или мутантного альфа-два бета-двух Salmonella typhimurium триптофан-синтазы с помощью центробежного фильтра мощностью 100 килодальтон путем вращения при 3000 раз больше g, при четырех градусах Цельсия. Переложите концентрированный белок в свежую двухмиллилитровую пробирку, и снова центрифугируйте при 10 000 г в течение 10 минут при четырех градусах, чтобы удалить агрегаты. После определения концентрации белка в образце приготовьте аликвоты объемом 0,5 миллилитра из расчета от 20 до 25 миллиграммов на миллилитр.

Мгновенно заморозьте их в жидком азоте, и храните при температуре минус 80 градусов. Приготовьте в воде пятимиллилитровый стоковый раствор 200-миллимолярного спермина, и храните его в аликвотах по 500 микролитров при температуре минус 20 градусов. Затем приготовьте 50-миллилитровый исходный раствор 30% полиэтиленгликоля 8000 в воде и выдержите 25 миллилитров в 50-миллилитровой одноразовой центрифужной конической колбе при температуре 25 градусов Цельсия.

Приготовьте 25-миллилитровые исходные растворы одномолярного хлорида цезия и хлорида натрия, каждый в воде, и держите их при температуре 25 градусов Цельсия. Приготовьте три набора 50-миллилитровых стоковых растворов одномолярного бицина и титруйте его гидроксидом цезия или гидроксидом натрия до получения буферных растворов при рН 7,6, 7,8 и 8. Держите 25-миллилитровые аликвоты растворов при температуре четыре градуса Цельсия.

Разморозьте образец альфа-двух бета-двух комплексов синтазы Salmonella typhimurium tryptophan в ледяной бане. Затем микроцентрифугируйте его при 10 000 умноженных на g в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия. Переложите прозрачную фракцию надосадочной жидкости в чистую центрифужную пробирку.

Оцените концентрацию белка надосадочной жидкости и разбавьте аликвоты до 15 мг на миллилитр 50-миллимолярным бицина цезия гидроксидом или бицина натрия гидроксидом pH 7,8, содержащим 50 миллимоляров цезия или натрия хлорида. Приготовьте 500 микролитров резервуарных растворов для трех 24-луночных сидячих планшетов в стерильных 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках. Варьируйте концентрацию ПЭГ 8, 000 и спермина, а также изменяйте pH буфера, как описано в текстовой рукописи для каждого набора.

Закройте пробирки крышками и энергично делайте вихри в течение 10 секунд, прежде чем центрифугировать их при 10 000 g в течение 10 минут при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы удалить пузырьки воздуха. Раздайте по 500 микролитров этого раствора в каждом резервуаре. Рассыпьте пять микролитров белкового раствора по 15 микрограммов на литр в каждую лунку для сидячих капель с помощью микропипетки P-10.

Затем добавьте по пять микролитров каждого соответствующего резервуарного раствора в белковую каплю. Избегайте образования пузырьков воздуха во время смешивания и не делайте пипетки вверх и вниз. Наконец, накройте тарелку прозрачной клейкой лентой и храните при температуре 25 градусов.

Кристаллы появляются через два-пять дней и вырастают до своих полных размеров в течение двух недель. Этот протокол был использован для субклонирования альфа-субъединицы и бета-субъединицы триптофансинтазы Salmonella typhimurium в модифицированный вектор pET SUMO. Здесь представлены репрезентативные результаты SDS-PAGE двух сильных полос, соответствующих белку слияния триптофансинтазы His6-SUMO-альфа и His6-SUMO-бета.

Каждый белок очищали с помощью аффинной хроматографии никель-нитрилотриуксусной кислоты и осаждения сульфата аммония с последующим расщеплением His-SUMO-tag, удалением следов His-SUMO-tag и измерением концентрации белка. Здесь показан профиль элюирования альфа-субъединицы, бета-субъединицы и альфа-двух бета-двух комплексов синтазы Salmonella typhimurium tryptophan synthase на SEC, а также чистота их пиковых фракций. После получения мутантных форм комплекса триптофансинтазы с помощью фракционирования сульфата аммония удаляли загрязняющие белки из гетерологичной системы экспрессии.

Здесь показан репрезентативный профиль элюирования с относительным положением элюирования альфа-двух бета-двух комплексов синтазы Salmonella typhimurium tryptophan synthase на колонке эксклюзионной хроматографии. Чистоту исключенных пиковых фракций анализировали с помощью SDS-PAGE перед объединением. Крупные монокристаллы были получены путем оптимизации тонкой кристаллизации путем варьирования концентраций PEG 8, 000 и спермина, а также pH буфера бицина.

Кристаллы с разной морфологией появлялись через два-пять дней и вырастали до полного размера в течение двух недель. После уточнения кристаллической структуры был выяснен валидация карт электронной плотности для кристаллической структуры комплекса триптофансинтазы альфа-двух бета-двух бета-двух Salmonella typhimurium triptophan synthase дикого типа. При выполнении этого протокола как можно скорее завершите начальные этапы очистки при комнатной температуре, чтобы предотвратить потерю активности триптофансинтазы.

Ожидается, что кристаллические структуры мутантов позволят по-новому взглянуть на механизм и роль, которую играют ключевые остатки в синтезе L-триптофана.