Котрансляционная вставка мембранных белков в предварительно сформированные нанодиски

Протокол отличается высокой эффективностью и универсальностью. Его можно наносить практически на любой мембранный белок, а вся производственная процедура завершается в течение суток. Синтезированные мембранные белки могут быть стабилизированы уже котрансляционно поставляемыми лигандами.

Контакт с моющими средствами полностью исключен, а белки вставляются и складываются непосредственно в специально оборудованных мембранных средах. Структурные подходы, функциональная характеристика и генерация антител являются основными областями применения. Кроме того, этот метод прост в анализе влияния липидов на сворачивание и функцию мембранных белков.

На третий день культивирования закиньте 10 литров стерильной среды YPTG с температурой 37 градусов Цельсия в 15-литровый реактор с перемешиванием и 100 миллилитров предварительной культуры. И культивируйте бактерии при температуре 37 градусов Цельсия со скоростью 500 оборотов в минуту при высокой аэрации. Чтобы предотвратить чрезмерное пенообразование, добавьте стерильный антипенник.

Когда клетки достигнут средней логарифмической фазы, добавьте в культуру 300 миллилитров этанола и инкубируйте клетки при температуре 42 градуса Цельсия с 500 оборотами в минуту в условиях высокой аэрации в течение еще 45 минут. В конце инкубации соберите клетки центрифугированием и с помощью шпателя и пипетки полностью ресуспендируйте клетки в 300 миллилитрах буфера S30A. Дважды центрифугируйте ресуспендированные бактерии, промывая гранулу 300 миллилитрами свежего S30A на одну стирку.

После второй промывки ресуспендируйте элементы в буфере S30B объемом 1,1. Загрузите суспензию в предварительно охлажденный ячеек давления френч-пресса и разрушьте ячейки при давлении 1000 фунтов на квадратный дюйм за один раз. Чтобы удалить любые нестабильные компоненты и высвободить мРНК из рибосом, отрегулируйте лизат до 0,4 молярного хлорида натрия и инкубируйте образец в течение 45 минут на водяной бане при температуре 42 градуса Цельсия.

Чтобы собрать мембранный каркас белковых нанодисков, смешайте раствор MSP1E3D1 с липидным раствором и добавьте DPC до конечной концентрации 0,1%, отрегулируйте реакцию до соответствующего конечного объема согласно таблице и инкубируйте реакции в течение одного часа при температуре 21 градус Цельсия при слабом перемешивании. По окончании инкубации предварительно смочите мембрану диализной кассеты с дисковым буфером и с помощью шприца загрузите сборочную смесь в кассету. Далее проводят реакцию диализа против трех пятилитровых объемов дискового буфера в течение 10-20 часов при комнатной температуре при перемешивании перед переносом смеси в дисковые газообразующие буферные уравновешенные центробежные фильтрующие установки с отсечкой молекулярной массы 10 килодальтон.

Затем концентрируйте реакцию до не менее 300 микромоляров путем центрифугирования с использованием УФ-ВИД ридера для измерения концентрации. Для приготовления трехмиллилитровой бесклеточной реакции непрерывного обмена необходимо уравновесить мембрану трехмиллилитровой диализной кассеты в 100 миллимолярном трис-ацетате. И с помощью шприца перенесите реакционную смесь в кассету.

С помощью шприца удалите лишний воздух из отсека реакционной смеси и поместите кассету в камеру для диализа. Заполните камеру 60 миллилитрами питательной смеси и накройте камеру крышкой. После фиксации крышки на месте инкубируйте камеру от 12 до 16 часов при температуре 30 градусов Цельсия со скоростью 200 оборотов в минуту.

Чтобы приготовить бесклеточную реакционную установку для клеточного обмена объемом 60 микролитров для скрининга ионов магния, добавьте 60 микролитров нашей свежеприготовленной 3X Master Mix в реакционную смесь и 825 микролитров в питательную смесь. И наполните питательную смесь водой. После вортекса добавьте по 825 микролитров питательной смеси в каждую из трех лунок 24-луночного микропланшета.

Разрежьте регенерированные целлюлозные диализные трубки с молекулярной массой от 10 до 14 килодальтон на кусочки размером примерно 25 на 20 мм и храните их в воде с добавлением 0,05% азида натрия. Перед сборкой бесклеточного контейнера для обмена мини-клетками используйте салфетку, чтобы удалить лишнюю воду с диализных мембран, и поместите по одному кусочку мембраны на каждый контейнер. Зафиксируйте мембраны политетрафторэтиленовым кольцом и перенесите мини-контейнер в одну лунку с питательной смесью.

Добавьте высокомолекулярные компоненты в реакционную смесь, как указано в таблице, и перемешайте с помощью пипетирования. Добавьте в реакционную емкость 60 микролитров реакционной смеси, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. И оберните два листа размером восемь на 10 сантиметров герметизирующей термопластичной пленкой вокруг 24-луночной пластины.

Зафиксируйте крышку луночной пластины на месте с помощью скотча и установите пластину при температуре 30 градусов Цельсия со скоростью 200 оборотов в минуту с перемешиванием на срок от 12 до 16 часов. На следующее утро с помощью наконечника пипетки проколите диализную мембрану в бесклеточном контейнере для обмена мини-клетками и отасуньте реакционную смесь. Переложите реакционную смесь в новые центрифужные пробирки и центрифугу для удаления осадка.

Затем переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Здесь показано репрезентативное влияние тонкой настройки реакционных соединений на конечный выход или качество синтезированных мембранных белков. В этом анализе общий синтез и солюбилизация нанодисков адренергического рецептора Т-бета-он были одинаковыми для всех анализируемых мембранных композиций.

Напротив, было обнаружено гораздо более высокое изменение качества синтезированного рецептора, связанного с G-белком, с наименьшей активностью, полученной при использовании липидов DMPC и POPC, и самой высокой, наблюдаемой при применении DOPG и POPG. В совокупности эти результаты указывают на то, что заряд липидной головной группы, а также гибкость цепи жирных кислот являются важными модуляторами для сворачивания и активности этого белка клеточной мембраны. Конечная концентрация нанодиска также может быть важным фактором для качества мембранного белка.

Например, если концентрацию нанодиска проводить в диапазоне от 3,75 до 60 микромоляров, то на примерно 30-микромолярных нанодисках достигается полная солюбилизация рецептора, связанного с G-белком, что дает соотношение мембранного белка к нанодиску от одного к трем. В противоположность этому, полная солюбилизация протеородопсина может быть достигнута с помощью примерно 10-микромолярных нанодисков, что дает соотношение протеородопсина к нанодискам 10 к одному. Точное пипетирование и высококачественные компоненты, безусловно, обязательны.

Критическими этапами получения лизата являются сбор клеток в середине логарифмической фазы и применение стадии с высоким содержанием соли. Этот метод значительно снижает сложность синтеза мембранных белков. Ранее сложные мишени эффективно синтезируются, что позволяет работать с молекулярными структурами до сих пор не изученных фармацевтически значимых белков.