Исследование динамики белка с помощью нейтронной спиновой эхо-спектроскопии

В следующем протоколе представлено, как настроить эксперимент Neutron Spin Echo для измерения промежуточной функции рассеяния и исследования динамики белков в растворе. Основным преимуществом нейтронной спиновой эхо-спектроскопии является ее способность смотреть на перегруппировку белковых доменов и субдоменов в масштабе времени пико до наносекунд; которая представляет собой диапазон замедленных движений в белках в их почти естественной среде и в переполненном белковом растворе. Нейтронное спиновое эхо также чувствительно к изотопной конфигурации, что позволяет проводить очень специфические и целенаправленные исследования с использованием контрастного сопоставления.

Понимание динамики белковых доменов является важной частью биофизических исследований в текущей сложной задаче по передаче движений белков с их биологической функциональностью. Протокол, представленный здесь, может быть применен к любому измерению нейтронного спинового эха, выполняемому на спектрометре SNS-NSE, независимо от вашего выбора образцов, если один из них остается в области материалов мягкого вещества. Чтобы установить эксперимент, начните с выбора толщины загрузки образца клетки, основанной на концентрации образца белка, температуре, необходимой для измерения, и количестве доступного раствора.

Очистите ячейку бесфосфатным моющим средством для посуды, деионизированной водой и 70% диэтанолом. Высушите ячейку в конвекционной печи. Загрузите четыре миллилитра белкового раствора в клетку и закройте крышками.

Используйте восковую пленку или любой герметик для герметизации клеток образца. Загрузите четыре миллилитра диализного буфера в тот же контейнер, что и образец белка и уплотнение. Транспортировка образцов на лучевую линию.

Закройте затвор и войдите в пещерную зону корпуса спектрометра. Установите ячейку образца на алюминиевый держатель образца, затянув винты и удерживающие пластины. Установите образец графита и образц порошка оксида алюминия, загруженный в контейнер, идентичный образцу белка.

Поместите тот же держатель, осторожно вставив его в банку системы температурного воздействия. Закройте крышку системы температурного воздействия и установите температуру на нужное значение, обратившись к интерактивному экрану системы температурного воздействия. Установите нейтронную камеру для выравнивания образцов по пучку.

Чтобы собрать данные нейтронной спиновой эхо-спектроскопии, выровняйте образец в пучке нейтронов с помощью нейтронной камеры и четырех независимых апертур образцов. Откройте spallation Neutron Source, программное обеспечение для сбора данных нейтронной спиновой эхо-спектроскопии и соберите статистику выборки, выполнив дефракционное сканирование для требуемых углов рассеяния и длины волны. Настройте параметры измерения на основе статистики, собранной для каждой выборки, путем редактирования макросов измерения, предоставленных вспомогательным специалистом по приборам.

Начните сканирование, введя имя протокола в командной строке и получив эхо для образца. Войдите в кластер удаленного анализа Neutron Sciences с учетными данными пользователя ORNL и нажмите кнопку запуска сеанса. В каталоге пользователя откройте окно терминала и введите команду настройки программного обеспечения.

Затем введите команду окружения. Создайте папку для сокращения данных в домашнем каталоге и скопируйте предоставленные сценарии и макросы из общего каталога. Отредактируйте, переименуйте и сохраните предоставленный макрос сокращения соответствующим образом.

Введите drspine” в командной строке и нажмите клавишу ВВОД, чтобы запустить среду сокращения программного обеспечения. Введите имя макроса уменьшения в командной строке в программной среде и нажмите клавишу ВВОД. Отредактируйте сценарий Python, предоставленный вспомогательным специалистом по инструментам, с именами данных уменьшенного файла.

Отредактируйте функцию в соответствии с предоставленной библиотекой. Введите имя редактируемого сценария в командной строке и нажмите клавишу ВВОД, чтобы прочитать, подогнать и построить уменьшенные данные NSE. Промежуточная функция рассеяния, измеренная NSE для белков IgG и MBP, показывает явное отклонение от простого диффузионно-подобного релаксационного процесса на короткой четырехлетней шкале времени, что указывает на доступность внутренней динамики белка по NSE и необходимость более сложной модели для описания наблюдаемых динамических процессов.

Результаты расчетов промежуточной функции рассеяния, выполненных атомарным моделированием обоих белков с использованием разработанных моделей, прекрасно согласовались с экспериментальными данными NSE. Результаты показали, что более медленная динамика, наблюдаемая в более длительное время скорняка, может быть отнесена к общим процессам трансляционной и ротационной диффузии, в то время как динамика, наблюдаемая в коротких временных масштабах, может быть отнесена к динамике белковых доменов. Важно помнить о необходимости хорошо подготовленных и чистых образцов для измерений NSE.

Хороший образец для Spin Echo имеет коэффициент переворачивания выше трех, который является соотношением между когерентным и некогерентным рассеянием образца. Кроме того, во время подготовки образцов и загрузки образцов в клетки NSE раствор образца должен храниться в безопасности и без каких-либо химических или биологических перекрестных загрязнений. По соображениям безопасности вход в корпус спектрометра следует предпринимать только после закрытия затвора, и для радиационного охлаждения корпуса было отведено дополнительное получасовое время.

Малоугловое рассеяние нейтронов рекомендуется для оценки формы и структуры белков в концентрированном растворе. Это может быть сделано до или параллельно с экспериментом NSE. Дополнительные методы, такие как динамическое рассеяние света и измерения вязкости, предоставляют информацию о поступательной диффузии и гидродинамическом взаимодействии в концентрированном белковом растворе, а также рекомендуются.