Метод перфузии Antegrade для выделения кардиомиоцитов у мышей
May 19th, 2021
Мы разработалиупрощенный метод выделения высококачественных отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной перфузии. Этот метод не содержит Лангендорфа и полезен для выделения желудочковых и предсердных миоцитов или интерстициальных клеток, таких как сердечные фибробласты или прародители.
Мы разработали простой метод без Лангендорфа для выделения отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной упаковки. Этот метод позволяет изолировать клетки сердца от ювенильных до пожилых мышей. Ретроградная перфузия на основе Лангендорфа считается золотым стандартом для выделения сердечных миоцитов у различных экспериментальных животных.
Тем не менее, канюляция LTA технически затруднена у мышей из-за их небольшого размера. Для сбора урожая сердца мыши, после подтверждения эвтаназии и бритья живота, быстро откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце, и используйте пластиковую переносную пипетку с наконечником, вырезанным примерно до размера сердца, чтобы засосать сердце в пипетку. Поднимите пипетку, чтобы создать достаточно места для вставки изогнутых ножниц и используйте ножницы, чтобы иссечить сердце со стороны дорсальной стороны, заботясь о том, чтобы не повредить предсердия.
Немедленно поместите сердце в 30-миллилитровый стеклянный стакан, содержащий ледяной CIB-EGTA, примерно на одну минуту. Когда схватки прекратились, поместите сердце в 35-миллилитровую культурную чашку, содержащую ледяной CIB-EGTA, и удалите легкое и другие видимые ткани. Поместите грубо очищенное сердце на подставку для сердца, заполненную охлажденной вершиной CIB-EGTA, стороной вниз и поместите подставку под стереоскопический микроскоп.
Удалите жировые и соединительные ткани вокруг аорты. Если длина разрезанной аорты слишком длинная, обрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией и сориентирует сердце так, чтобы передняя поверхность была обращена вперед. Используйте пинцет, чтобы поднять конец аорты и использовать небольшой сосудистый зажим, чтобы зажать аорту возле предсердия, осторожно надавливая на предсердия.
Затем поместите зажатое сердце на перфузионную пластину передней стороной вверх и увлажните сердце несколькими каплями CIB-EGTA. Для антеградной перфузии загрузите 20-миллилитровый шприц, содержащий предварительно выровненный CIB-EGTA, соединенный с гибкой удлинительной трубкой и маркированной инъекционной иглой, на инфузионный насос и запустите насос со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту. Когда игла и насос будут заполнены, поместите инъекционную иглу на перфузионную пластину с более короткой стороной диагональной формы спереди и сдвиньте иглу, пока она не коснется вершины сердца.
Осторожно вставьте иглу около вершины левого желудочка в желудочковую камеру, не скручивая и не отсоедив иглу от пластины, наблюдая за меткой, чтобы оценить глубину введения иглы. Когда введение иглы завершено, кровь должна начать течь из коронарной артерии. Используйте ленту, чтобы закрепить инъекционную иглу на пластине и увеличить скорость насоса до одного миллилитра в минуту.
Если сердце успешно перфузировано, поток буфера в капилляре должен быть виден как раз под эпикардом. После двух-трех миллилитров перфузии CIB-EGTA замените перфузионный буфер ферментной смесью. После того, как один-два миллилитра были перфузированы, увеличьте скорость насоса до 1,5 миллилитра в минуту.
Используйте пипетку для удаления накопленного кровьсодержащего перфусата, вытекающего из сердца по мере необходимости, и остановите перфузию, когда общий объем перфузированного фермента достигнет 10 миллилитров. В конце перфузии переложите 10 миллилитров ферментной смеси со шприца на 60-миллиметровую культуральную посуду на нагревательном коврике и добавьте в блюдо 20 миллиграммов BSA. Аккуратно закрутите блюдо, чтобы растворить порошок и вынуть инъекционную иглу и зажим от сердца.
Удалите желудочки и предсердия из сердца и поместите ткани в смесь ферментов, дополненную BSA. Чтобы изолировать желудочковые миоциты, используйте две пары пинцетов, чтобы захватить эпикард и осторожно вытянуть желудочки на мелкие кусочки. Когда все фрагменты желудочков будут сформированы, рассейте клетки примерно 30 раз с мягким пипетированием и отфильтруйте непереваренный мусор через 100-микронный сетчатый клеточный сетчатый фильтр в 15-миллилитровую центрифужную трубку.
После центрифугирования повторно суспендируют гранулу кардиомиоцитов в предварительном CIB, дополненном кальцием и BSA, и инкубируют клетки в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации центрифугируют клетки снова и повторно суспендируют осажденные кардиомиоциты в соответствующем объеме клеточного раствора для их поддержания при 37 градусах Цельсия до последующего анализа. Чтобы изолировать предсердные миоциты, перенесите предсердия в контейнер с доварным CIB, дополненным кальцием и BSA, и разорвите предсердия на части, как показано.
Используйте пипетку размером 20 микролитров, установленную на 10 микролитров, чтобы разрушить ткани путем пипетирования и собрать диссоциированные клетки путем центрифугирования. Затем повторно суспендирует предсердную клетку в соответствующем объеме клеточного раствора. На этом изображении можно наблюдать свежеизолированные желудочковые миоциты.
Эта процедура изоляции приводит к выходу от 70 до 80% палочковидных желудочковых миоцитов в форме покоя от восьми до 10-недельных мышей в течение примерно пяти часов после изоляции. Соотношение свежеизолированных жизнеспособных клеток ниже у мышей старше двух лет. Потенциалы действия, зарегистрированные в желудочковых и предсердных миоцитах, аналогичны тем, которые измеряются в клетках, полученных методом Лангендорфа.
Иммуноразрушающий анализ может быть использован для оценки организации саркомергической структуры желудочковых миоцитов и трансформации сердечных фибробластов в миофибробласты после субкультуры. Вестерн-блот-анализ рекомендуется для определения специфической экспрессии интересующих белков в предсердиях и желудочках после обработки. После перфузии ферментами белки из предсердий и желудочков могут быть легко гомогенизированы в буфере лизиса с легкой силой для экстракции белка.
Важно контролировать направление и глубину введения иглы. При введении иглы в левый желудочек позаботьтесь о том, чтобы не проткнуть желудочковую перегородку или не проникнуть в клапан. Можно менять состав перфусата в зависимости от цели эксперимента.
Например, моющее средство, дополненное EGTA, может быть использовано для создания бесклеточного каркаса сердца.
Обзор
Это исследование посвящено решению задачи изоляции отдельных клеток сердца мыши, что является ключевым для кардиологических исследований. Авторы разработали метод без использования Langendorff, использующий антероградную перфузию для эффективной изоляции клеток от мышей различного возраста, что значительно улучшает доступ к определенным типам кардиальных клеток.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Изоляция кардиальных клеток
- Биология сердца мыши
- Техники культивирования клеток
Фон
- Традиционные методы Langendorff сталкиваются с техническими трудностями у мышей из-за их размера.
- Изоляция клеток критически важна для понимания кардиальной функции и патологии.
- Разработка доступных методов приносит пользу широкому диапазону кардиологических исследований.
Используемые методы
- Техника антероградной перфузии
- Мышь-модель системы
- Использование специфических буферов и ферментов для диссоциации клеток
Основные результаты
- Эффективная изоляция желудочковых и предсердных миоцитов с высокой жизнеспособностью клеток (70-80% выход).
- Потентциалы действия клеток, схожие с теми, что получают из методов Langendorff.
- Подробные процедурные шаги для оптимальной извлечения клеток.
Выводы
- Это исследование представляет упрощенный, эффективный метод изоляции кардиальных клеток из сердца мыши.
- Подход имеет важное значение для продвижения методологий кардиологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of viable cardiomyocytes from mouse hearts is a critical enabler for early discovery and mechanistic studies in cardiovascular drug research. The antegrade perfusion method eliminates the technical barriers of Langendorff-based retrograde perfusion, expanding access to high-quality cardiac cells across a broader range of mouse ages. This capability supports robust target validation and functional assays, directly impacting predictive confidence in cardiovascular R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cardiac-specific hypotheses using freshly isolated ventricular and atrial myocytes.
- Supports biological de-risking by providing high-viability cells for functional and molecular assays.
- Facilitates mechanistic studies on cardiac cell types, improving predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible isolation of cardiomyocytes and fibroblasts for downstream assay development.
- Delivers quantitative cell yields suitable for electrophysiological and protein expression analyses.
- Enables preparation of validated cardiac cell systems for compound screening and functional readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant cardiac models by supporting isolation from juvenile to aged mice.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation with consistent cell quality and viability.
- Supports translational biomarker studies through compatibility with immunostaining and Western blot analyses.
Pipeline & Workflow Integration
This antegrade perfusion method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a reliable source of primary cardiac cells for hypothesis testing, assay development, and mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Enables robust null hypothesis testing and pathway clarification using freshly isolated cardiomyocytes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell preparations for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Supports quantitative readouts such as action potential measurements and protein expression profiling.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and biomarker validation through high-quality cell isolation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Improves standardization, reproducibility, and scalability of cardiac cell isolation workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in cardiovascular portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microsurgical dissection and perfusion under stereomicroscopy.
- Needs access to infusion pumps, heater mats, and analytical infrastructure for downstream assays.
- Demands cross-team standardization of perfusion parameters and cell handling protocols.
- Adaptable to various mouse ages, but cell yield and viability may decrease in older animals.
- Careful control of needle insertion depth and perfusate composition is essential for reproducibility.
