Метод перфузии Antegrade для выделения кардиомиоцитов у мышей

Мы разработали простой метод без Лангендорфа для выделения отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной упаковки. Этот метод позволяет изолировать клетки сердца от ювенильных до пожилых мышей. Ретроградная перфузия на основе Лангендорфа считается золотым стандартом для выделения сердечных миоцитов у различных экспериментальных животных.

Тем не менее, канюляция LTA технически затруднена у мышей из-за их небольшого размера. Для сбора урожая сердца мыши, после подтверждения эвтаназии и бритья живота, быстро откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце, и используйте пластиковую переносную пипетку с наконечником, вырезанным примерно до размера сердца, чтобы засосать сердце в пипетку. Поднимите пипетку, чтобы создать достаточно места для вставки изогнутых ножниц и используйте ножницы, чтобы иссечить сердце со стороны дорсальной стороны, заботясь о том, чтобы не повредить предсердия.

Немедленно поместите сердце в 30-миллилитровый стеклянный стакан, содержащий ледяной CIB-EGTA, примерно на одну минуту. Когда схватки прекратились, поместите сердце в 35-миллилитровую культурную чашку, содержащую ледяной CIB-EGTA, и удалите легкое и другие видимые ткани. Поместите грубо очищенное сердце на подставку для сердца, заполненную охлажденной вершиной CIB-EGTA, стороной вниз и поместите подставку под стереоскопический микроскоп.

Удалите жировые и соединительные ткани вокруг аорты. Если длина разрезанной аорты слишком длинная, обрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией и сориентирует сердце так, чтобы передняя поверхность была обращена вперед. Используйте пинцет, чтобы поднять конец аорты и использовать небольшой сосудистый зажим, чтобы зажать аорту возле предсердия, осторожно надавливая на предсердия.

Затем поместите зажатое сердце на перфузионную пластину передней стороной вверх и увлажните сердце несколькими каплями CIB-EGTA. Для антеградной перфузии загрузите 20-миллилитровый шприц, содержащий предварительно выровненный CIB-EGTA, соединенный с гибкой удлинительной трубкой и маркированной инъекционной иглой, на инфузионный насос и запустите насос со скоростью потока 0,5 миллилитра в минуту. Когда игла и насос будут заполнены, поместите инъекционную иглу на перфузионную пластину с более короткой стороной диагональной формы спереди и сдвиньте иглу, пока она не коснется вершины сердца.

Осторожно вставьте иглу около вершины левого желудочка в желудочковую камеру, не скручивая и не отсоедив иглу от пластины, наблюдая за меткой, чтобы оценить глубину введения иглы. Когда введение иглы завершено, кровь должна начать течь из коронарной артерии. Используйте ленту, чтобы закрепить инъекционную иглу на пластине и увеличить скорость насоса до одного миллилитра в минуту.

Если сердце успешно перфузировано, поток буфера в капилляре должен быть виден как раз под эпикардом. После двух-трех миллилитров перфузии CIB-EGTA замените перфузионный буфер ферментной смесью. После того, как один-два миллилитра были перфузированы, увеличьте скорость насоса до 1,5 миллилитра в минуту.

Используйте пипетку для удаления накопленного кровьсодержащего перфусата, вытекающего из сердца по мере необходимости, и остановите перфузию, когда общий объем перфузированного фермента достигнет 10 миллилитров. В конце перфузии переложите 10 миллилитров ферментной смеси со шприца на 60-миллиметровую культуральную посуду на нагревательном коврике и добавьте в блюдо 20 миллиграммов BSA. Аккуратно закрутите блюдо, чтобы растворить порошок и вынуть инъекционную иглу и зажим от сердца.

Удалите желудочки и предсердия из сердца и поместите ткани в смесь ферментов, дополненную BSA. Чтобы изолировать желудочковые миоциты, используйте две пары пинцетов, чтобы захватить эпикард и осторожно вытянуть желудочки на мелкие кусочки. Когда все фрагменты желудочков будут сформированы, рассейте клетки примерно 30 раз с мягким пипетированием и отфильтруйте непереваренный мусор через 100-микронный сетчатый клеточный сетчатый фильтр в 15-миллилитровую центрифужную трубку.

После центрифугирования повторно суспендируют гранулу кардиомиоцитов в предварительном CIB, дополненном кальцием и BSA, и инкубируют клетки в течение пяти минут при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации центрифугируют клетки снова и повторно суспендируют осажденные кардиомиоциты в соответствующем объеме клеточного раствора для их поддержания при 37 градусах Цельсия до последующего анализа. Чтобы изолировать предсердные миоциты, перенесите предсердия в контейнер с доварным CIB, дополненным кальцием и BSA, и разорвите предсердия на части, как показано.

Используйте пипетку размером 20 микролитров, установленную на 10 микролитров, чтобы разрушить ткани путем пипетирования и собрать диссоциированные клетки путем центрифугирования. Затем повторно суспендирует предсердную клетку в соответствующем объеме клеточного раствора. На этом изображении можно наблюдать свежеизолированные желудочковые миоциты.

Эта процедура изоляции приводит к выходу от 70 до 80% палочковидных желудочковых миоцитов в форме покоя от восьми до 10-недельных мышей в течение примерно пяти часов после изоляции. Соотношение свежеизолированных жизнеспособных клеток ниже у мышей старше двух лет. Потенциалы действия, зарегистрированные в желудочковых и предсердных миоцитах, аналогичны тем, которые измеряются в клетках, полученных методом Лангендорфа.

Иммуноразрушающий анализ может быть использован для оценки организации саркомергической структуры желудочковых миоцитов и трансформации сердечных фибробластов в миофибробласты после субкультуры. Вестерн-блот-анализ рекомендуется для определения специфической экспрессии интересующих белков в предсердиях и желудочках после обработки. После перфузии ферментами белки из предсердий и желудочков могут быть легко гомогенизированы в буфере лизиса с легкой силой для экстракции белка.

Важно контролировать направление и глубину введения иглы. При введении иглы в левый желудочек позаботьтесь о том, чтобы не проткнуть желудочковую перегородку или не проникнуть в клапан. Можно менять состав перфусата в зависимости от цели эксперимента.

Например, моющее средство, дополненное EGTA, может быть использовано для создания бесклеточного каркаса сердца.