Бесклеточная продукция протеолипосом для функционального анализа и разработки антител, нацеленных на мембранные белки

Все мембранные белки являются важными мишенями при разработке лекарств. Крупнейшее производство мембранных белков остается узким местом для проведения биохимических, биофизических и структурных исследований мембранных белков. Этот метод может быть использован для эффективного синтеза мембранных белков in vitro и получения очищенных протеолипосом в короткие сроки с высокой вероятностью успеха.

После добавления соответствующих реагентов, в том числе бесклеточной экспрессионной плазмиды для получения реакционной смеси транскрипции, перемешайте содержимое пробирки путем осторожной инверсии или постукивания и выполните быстрое вращение в микроцентрифуге. После отжима инкубируйте смесь реакции транскрипции в течение шести часов при 37 градусах Цельсия с последующим перемешиванием и понижением спина. Для приготовления буфера для трансляции разбавьте стоковый раствор свежей ультрачистой водой.

Для мелкомасштабной трансляции используйте диализные чашки объемом 100 микролитров, промытые сверхчистой водой, чтобы удалить глицерин с диализной мембраны. Добавьте один миллилитр сверхчистой воды в новую 1,5-миллилитровую трубку и вставьте в нее небольшой диализный стаканчик. Затем добавьте в чашку 500 микролитров сверхчистой воды для 30-минутной инкубации при комнатной температуре.

Чтобы приготовить липосомы, переложите липидный раствор, содержащий 50 миллиграмм липидов, в испарительную колбу. Поместите колбу во вращающийся испаритель, чтобы выпарить растворитель. Когда на поверхности дна колбы образуется тонкий, равномерно распределенный слой липидов, перенесите колбу в вакуумный эксикатор под отрицательным давлением на ночь, чтобы полностью удалить растворитель.

На следующее утро извлеките колбы из эксикатора и проверьте тонкую пленку липидов. Добавьте в колбу один миллилитр буфера для трансляции и поверните колбу, чтобы распределить буфер по тонкой липидной пленке. Через пять минут произведите ультразвуковую обработку колбы, время от времени меняя угол, чтобы раствор соприкасался со всей поверхностью липидной пленки.

Прекращают обработку ультразвуком, когда липид полностью удаляется из колбы и липосомная суспензия становится равномерной. Затем перенесите липосомальную суспензию в новую 1,5-миллилитровую трубку. Перед проведением трансляции белка in vitro пробирку с экстрактом зародышей пшеницы при температуре минус 80 градусов храните на воде при комнатной температуре в течение нескольких минут, чтобы быстро разморозить материал.

После размораживания экстракта немедленно перемешайте содержимое тюбика путем осторожной инверсии. Затем открутите вниз и поставьте трубку на лед. Добавьте экстракт зародышей пшеницы, мРНК и липосомы, чтобы получить смесь для реакции трансляции.

Перемешайте содержимое пробирки с помощью осторожной инверсии или постукивания и выполните быстрый отжим в микроцентрифуге. Чтобы провести малую трансляцию белка in vitro, удалите воду из малого диализного стакана и пробирки и добавьте один миллилитр буфера для трансляции в пробирку и 300 микролитров в чашку. Возьмите 60 микролитров реакционной смеси для трансляции.

Вставьте наконечник пипетки в буфер для трансляции в диализном стакане. Затем медленно и аккуратно вводите смесь. Реакционная смесь с более высокой плотностью самопроизвольно опускается на дно чашки и образует слой.

Накройте чашку крышкой, чтобы предотвратить испарение. Чтобы провести крупномасштабную трансляцию, добавьте 22 миллилитра буфера для трансляции в 25-миллилитровую трубку и поместите в нее двухмиллилитровый диализный стаканчик. Добавьте два миллилитра буфера для трансляции в диализный стаканчик.

Возьмите 500 микролитров смеси для реакции трансляции, медленно и аккуратно введите смесь в буфер для трансляции в чашке. Инкубируйте реакции в течение 24 часов при температуре 15 градусов Цельсия. На следующий день тщательно перемешать реакцию в диализном стакане методом пипетирования и перенести сырые протеолипосомные суспензии в новые пробирки.

Чтобы очистить протеолипосомы, осадите протеолипосомы в сырых суспензиях путем центрирования. Затем промыть протеолипосому путем ресуспендирования в соответствующем объеме ледяного PBS буфера три раза. После промывки тщательно ресуспендируйте протеолипосомные гранулы в небольшом объеме PBS и измерьте объем суспензии с помощью микропипетки.

Затем добавьте PBS для регулировки громкости суспензии. Переложите каждую суспензию в новую микротрубку. Чтобы настроить анализ страницы SDS, добавьте 70 микролитров воды и 40 микролитров буфера для образцов страницы SDS с трехкратной концентрацией в 10 микролитров каждой суспензии протеолипосом.

Установите страничный гель с градиентом от 5 до 20% в камере для электрофореза. Загрузите в гель два микролитра маркера размера белка три, шесть и 12 микролитров каждого образца протеолипосомы и 10 микролитров стандарта бычьего сывороточного альбумина. После загрузки образцов запустите электрофорез с последующим окрашиванием геля красителем Coomassie Brilliant Blue.

Наконец, обесцвечьте гель в горячей воде с помощью осторожного встряхивания и отсканируйте изображение геля. Используя этот протокол, как показано, разнообразные мембранные белки с тремя или более трансмембранными спиралями могут быть легко получены в виде протеолипосом за короткое время. При использовании этого метода двухслойного диализа можно эффективно осуществлять непрерывную подачу субстратов и удаление побочных продуктов как в верхней, так и в нижней части реакционной смеси в течение длительного периода времени, что приводит к превосходной эффективности трансляции.

Метод двухслойного диализа приводит к увеличению производительности в 4-10 раз по сравнению с использованием только двухслойного или диализного методов. Забор синтезированных протеолипосом методом центрирования и их частичная очистка с помощью промывочного буфера значительно сокращает процесс очистки мембранных белков. Эта бесклеточная система проста в управлении и обладает высокой масштабируемостью.

Он также может быть использован для производства белков памяти, которые трудно экспрессировать с помощью других методов. Этот метод чрезвычайно полезен для исследований и экспериментов, в которых используются или нацелены на мембранные белки, такие как антимембранный белок, продукция антител, SPR, Elisa и AlphaScreen.