Выделение жизнеспособных адипоцитов и стромально-васкулярной фракции из висцеральной жировой ткани человека, пригодных для анализа РНК и фенотипирования макрофагов

Этот протокол позволяет выделить и изучить жизнеспособные адипоциты и клетки SVF стромальной васкулярной фракции из висцерального жира человека. Ферментативное расщепление с использованием коллагеназы обеспечивает высокий выход общей РНК из зрелых адипоцитов, включая микроРНК, пригодные для анализа экспрессии. Одновременно метод оптимизирован для идентификации макрофагов методом проточной цитометрии.

Этот протокол содержит основные рекомендации по устранению неполадок для простого и эффективного выделения жизнеспособных зрелых адипоцитов и клеток SVF из биопсии человека с НДС в рамках одного процесса. После закрытия матки и гемостаза определите большой сальник и натяните его на влажный компресс. Определите аваскулярную зону и с помощью щипцов Келли просверлите внешнюю сторону висцеральной жировой ткани, или VAT.

С помощью щипцов Окснера зажмите проксимальную и дистальную сторону в зоне, где был просверлен НДС, а с помощью ножниц Метценбаума разрежьте ткань. Перевяжите большой сальник черным шелком номер один, затем удалите щипцы Окснера и оцените гемостаз. Чтобы выполнить ферментативное разложение, отрежьте четыре грамма НДС и с помощью ножниц измельчите ткань на мелкие кусочки в лотке для препарирования.

Переложите кусочки в новую стерильную 50-миллилитровую центрифужную пробирку и добавьте 25 миллилитров раствора для варежки. Инкубируйте пробирку при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут в орбитальном вибростенде со скоростью 125 оборотов в минуту. Затем отфильтровать переваренную ткань через три слоя марли в новую стерильную 50-миллилитровую центрифужную пробирку.

Центрифугируйте пробирку при 200 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования должны быть видны две фазы. Верхняя фаза соответствует зрелым адипоцитам, в то время как клетки SVF остаются в грануле.

Перенесите зрелые адипоциты в трубку. Лизируйте клетки, добавив 1000 микролитров реагента на основе кислоты, гуанидиния и фенола, и тщательно перемешайте с помощью микропипетки P1000 для гомогенизации. Инкубируйте смесь в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы усилить диссоциацию нуклеопротеиновых комплексов.

Центрифугируйте лизат клеток в течение пяти минут при 12 000 G для получения трех фаз: верхней желтой фазы, соответствующей липидам адипоцитов, средней розовой фазы, соответствующей нуклеиновым кислотам, и гранулы с клеточным мусором. Осторожно удалите липидный слой с помощью микропипетки P200. Затем перенесите среднюю фазу в новую двухмиллилитровую трубку, стараясь не потревожить другие фазы.

После очистки РНК и измерения концентрации с помощью УФ-спектрофотометра видимого диапазона используйте набор для определения числа целостности РНК. Затем используйте набор для малых РНК для определения концентрации и процента микроРНК. Поместите зажим в биоанализатор.

Разведите 10 микролитров клеточной суспензии SVF в 90 микролитрах 0,4%-ного раствора трипанового синего цвета, и нанесите 10 микролитров на стандартный гемоцитометр. Тщательно подсчитайте жизнеспособные клетки, исключая мертвые, в четырех квадратах в углу счетной камеры. Перенесите в общей сложности 1 миллион клеток SVF на миллилитр в пятимиллилитровую полипропиленовую пробирку с круглым дном для проточной цитометрии и гранулируйте клетки центрифугированием при 800 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Вихрь осторожно разрыхлить гранулы и повторно суспендировать клетки в 100 микролитрах PBS. Добавьте предварительно титруемую оптимальную концентрацию каждого конъюгированного флуорохромом моноклонального антитела, специфичного для антигена клеточной поверхности, и осторожно перемешайте, затем инкубируйте клетки в течение 15 минут в темноте. Добавьте избыток холодного PBS.

И центрифугировать SVF при 400 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость, стараясь не потревожить гранулы. Повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах жидкости оболочки.

Затем отфильтруйте клетки через три слоя марли в новую пятимиллилитровую полипропиленовую пробирку с круглым дном. Перед анализом кратко обработайте каждую трубку и подсчитайте минимум 10 000 событий для анализа потока. Этот протокол экстракции РНК был использован для получения адекватной чистоты и высокой целостности РНК и микроРНК из зрелых адипоцитов.

Целостность РНК оценивали с помощью анализатора контроля качества РНК. Примерно в 2,8 раза от 10 до шести ядерных клеток присутствовало на грамм висцеральной жировой ткани. Клетки стромальной васкулярной фракции были помечены флуорофор-конъюгированными первичными антителами для идентификации и характеристики 18 макрофагов с помощью флуоресцентно-активируемого анализа сортировки клеток.

Агрегаты ячеек были исключены из анализа путем построения графика зависимости области прямого рассеяния от высоты прямого рассеяния. Затем клеточный мусор был исключен путем стробирования клеток, исходя из правильного размера и сложности, с использованием области прямого рассеяния и области бокового рассеяния. Для анализа макрофагов моноциты и клетки линии макрофагов отбирали с использованием маркеров CD45 и CD14.

Впоследствии двойные положительные клетки CD45-CD14 были отделены на основе экспрессии маркера макрофагов HLA-DR. Были выделены две подгруппы макрофагов. В дополнение к выявлению новых клеточных фенотипов, этот протокол позволяет использовать очищенные клеточные популяции для будущих анализов, таких как метилирование ДНК, посттрансляционные модификации и сигнальные пути.