Яйцо Микроинъекции и эффективного спаривания для редактирования генома в Firebrat Thermobia domestica

Поскольку Thermobia domestica является базальным насекомым, генетические исследования этого вида прольют свет на механизмы, лежащие в основе эволюции ключевых инноваций у насекомых, таких как моторный полет и метаморфозы. Этот протокол охватывает основные методы от поддержания культуры до микроинъекции яйцеклеток для реализации Thermobia в качестве лабораторной модели вида. Этот метод также может быть использован для применения других генетических инструментов, таких как нокдаун генов, опосредованный RNI, и трансгенез у термоб.

Поддерживайте популяции диких типов и мутантов в большом пластиковом контейнере с обычным искусственным кормом для рыб, водой в пластиковых стаканчиках с вентиляционным отверстием сверху, сложенной бумагой для укрытия насекомых и слоеной ватой для откладывания яиц. Храните все культуры T.domestica в инкубаторах с температурой 37 градусов Цельсия и установите относительную влажность внутри каждого контейнера на уровне от 60 до 80%.Чтобы подготовить яйцесборные колонии, пересадите около 20 самцов и 20 самок в контейнер среднего размера с едой, запасом воды, сложенной бумагой и небольшим куском слоеного хлопка для откладывания яиц. Создайте несколько колоний, чтобы получить большое количество стадийных эмбрионов за короткий промежуток времени.

В день инъекции замените вату внутри контейнеров на новую вату. Через восемь часов соберите яйцеклетки из слоистого хлопка, отделив слои с помощью щипцов. Выровняйте яйца на двустороннем скотче с помощью влажной малярной кисти, соблюдая расстояние между яйцами в два миллиметра.

Все яйца должны быть ориентированы таким образом, чтобы продольная ось яйца была обращена к стороне инъекции. Аккуратно придавите яйца кистью для крепкого удержания во время инъекции. Загрузите два микролитра раствора гРНК CAS9 в стеклянный капилляр для инъекций с помощью микрозагрузчика.

Перед инъекцией убедитесь, что в растворе нет пузырьков воздуха. При необходимости постучите по игле, чтобы удалить пузырьки. Оптимизируйте форму кончика иглы, слегка сломав его щипцами, чтобы предотвратить засорение и добиться большей прочности во время серии инъекций.

Введите иглу в середину продольной оси яйца и введите небольшое количество раствора. Регулируйте конфигурацию электронного микроинъектора во время инъекции в зависимости от формы кончика иглы. Храните введенные яйца в контейнере соответствующего размера с относительной влажностью от 60 до 80% при температуре 37 градусов Цельсия.

Периодически проверяйте введенные яйца и отбраковывайте поврежденные яйца, чтобы избежать роста грибков. Если на яйце растет слишком много грибка, очистите поверхность яйца 70% этанолом. Перед вылуплением окуните предметное стекло с введенными яйцами в тальк для покрытия поверхности двусторонним скотчем.

Это предотвратит укладку вылупившихся нимф. Переложите стеклянные стекла с порошковым покрытием в контейнер среднего размера с едой, водой и сложенной бумагой. Изолируйте нимфы G1 в 24 луночные пластины с помощью аспиратора или кисти.

Поддерживайте запас искусственного регулярного корма для рыб. Поместите 24 луночные пластины в большую емкость с запасом воды для влажности от 60 до 80% Зажмите церкус у нимфы или взрослой особи с помощью щипцов и соберите их в 0,2 миллилитровую пробирку, содержащую 50 микролитров этанола. Собранные образцы храните при температуре минус 20 градусов Цельсия для длительного хранения.

Поместите пробирки с образцами с открытыми крышками на термоблок на 15 минут при температуре 70 градусов Цельсия, чтобы выпарить этанол. Инъекция комплекса рибонуклеопротеинов гРНК CAS9 в эмбрионы в течение первых восьми часов после откладки яиц приводит к образованию инделов в целевом сайте гРНК. Это приводит к биаллельным мутациям в некоторых клетках инъецируемого поколения и обычно получают мутантные мозаичные фенотипы.

Когда этот протокол был использован для введения гРНК, которая была разработана для нацеливания на белый ген, у 32,6% нимф G0 наблюдалась частичная потеря пигментации в сложных глазах и дорсальных областях. Оценка трансформации зародышевой линии взрослых G0 и мутировавших G1 индивидуумов проводилась с помощью геномной ПЦР с последующим анализом гетеродуплексной подвижности. В образцах G1 четко различимы дифференциальные полосы между диким типом и мутировавшими образцами.

Редактирование генома в Thermobia обеспечивает надежный подход к анализу генетических механизмов, лежащих в основе преждевременных признаков насекомых. Это помогает раскрыть секреты их выдающегося успеха и нашего успеха.