Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Этот протокол может обеспечить высокопроизводительные измерения клеточной электрофизиологии таким образом, который соответствует быстро развивающейся технологии индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она менее сложна и менее трудоемка, чем традиционная техника наложения пластыря, но при этом способна дать эквивалентные результаты. Таким образом, этот протокол может быть расширен для крупномасштабных программ скрининга токсичности с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека кардиомиоцитов.

Например, комплексный анализ на проаритмию in vitro. Чтобы получить индуцированные плюрипотентные культуры кардиомиоцитов, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, для эксперимента, сначала нанесите 150 микролитров матрицы базальной мембраны 1:60 в каждой лунке 24-луночного планшета и инкубируйте защитные стекла при температуре четыре градуса Цельсия в течение четырех часов. По окончании инкубации удалите излишки матрицы из покровных стеблей и нанесите соответствующий объем ячеек на каждый покровный лист.

Через час при температуре 37 градусов Цельсия тщательно заполните каждую лунку плоской средой и верните тарелку в инкубатор. Чтобы подготовиться к резиденции, чувствительной к напряжению, оснастите инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп объективом с высокой числовой апертурой с 40-кратным увеличением и подключите быстро переключающийся теплый белый светодиод к порту передаваемого освещения. Вставьте простой красный фильтр с разрешением 660 нанометров в проходящий свет и установите быстро переключающуюся светодиодную головку на 470 нанометров для фотометрической записи.

Вставьте фильтр возбуждения 470/40 в эпифлуоресцентный порт, чтобы очистить свет, генерируемый светодиодом, и вставьте куб микроскопа, содержащий светоделитель длиной 495 нанометров, в карусель зеркального блока внутри микроскопа. Установите манипулятор детектирования с регулируемой полевой диафрагмой на порт крепления C, чтобы можно было выбрать интересующую область, и подключите детектор ФЭУ и USB-камеру к микроскопу. Вставьте куб фильтра, содержащий светоделитель длиной 565 нанометров и фильтр излучения 535/50, в порт ФЭУ, чтобы распределить свет излучения между двумя детекторами.

Подключите ФЭУ к источнику питания и усилителю ФЭУ и подключите выход усилителя ФЭУ к выводу аналогового входа системы сбора данных. Чтобы выполнить критерии Найквиста и предотвратить наложение искажений, фильтруйте аналоговые данные из ФЭУ с частотой в один килогерц или выше и оцифруйте данные с частотой, которая как минимум в два раза превышает частоту самой высокой частоты, присутствующей в аналоговом сигнале. Чтобы загрузить элементы сильночувствительным красителем, смешайте пять микролитров 1000x FluoVolt и 50 микролитров раствора для силовой нагрузки и добавьте три микролитра полученного загрузочного раствора к трем миллилитрам подогретого раствора Tyrode в чашке Петри.

Добавьте в форму покровный лист, покрытый одним индуцированным плюрипотентным стволовым клеткой, покрытым кардиомиоцитами, и поставьте чашку при температуре 37 градусов Цельсия на 20 минут. Установите нагретую камеру для визуализации живых клеток на предметный столик микроскопа и заполните камеру 500 микролитрами свежего раствора Tyrode. Затем промойте чехол свежим раствором Tyrode при температуре 37 градусов Цельсия и с помощью тонкоточечных щипцов аккуратно перенесите чехол в предварительно прогретую камеру ванны.

Чтобы стандартизировать клеточную динамику и экспериментальные параметры, вставьте два платиновых электрода в камеру, расположенную на расстоянии пяти миллиметров друг от друга, и подключите электроды к внешнему стимулятору. Установите стимулятор на пять миллисекундных импульсов биполярного поля с частотой 0,5 герц и увеличивайте стимул с одного вольта до тех пор, пока клетки не начнут сокращаться. Затем установите напряжение примерно на 25% выше этого порога.

Для регистрации потенциала оптического действия используйте проходящий световой тракт и USB-камеру для визуализации миоцитов в условиях светлого поля. Выберите изолированную ячейку и с помощью полевой диафрагмы плотно обрезайте ее оптический путь, гарантируя, что контролируется только свет от интересующей клетки. Активируйте усилитель ФЭУ и установите напряжение питания ФЭУ на 750 вольт.

Запустите протокол стимуляции вместе с программным обеспечением для сбора данных, одновременно активируя возбуждающий свет с частотой 470 нанометров. Запишите 10 разверток, чтобы обеспечить обнаружение стабильных потенциалов действия. После последнего развертки немедленно переместите предметный столик микроскопа во время записи, чтобы кратковременно получить фоновый сигнал из области, лишенной клеток, и выключить возбуждающий свет.

Чтобы проанализировать данные о потенциале действия, откройте сохраненную запись в соответствующем аналитическом программном обеспечении и усредните 10 разверток, содержащих стимулированные потенциалы действия, из одной ячейки. Вычтите среднее значение базового сигнала, представляющего смещение флуоресценции, из среднего следа, затем используйте формулу для вычисления изменения флуоресценции с использованием диастолической флуоресценции как F0. Определите области диастолического потенциала и потенциала действия и измерьте желаемые параметры потенциала сердечного действия, включая, помимо прочего, продолжительность при 50% и 90% реполяризации. Затем экспортируйте данные из этой единственной ячейки в программу для работы с электронными таблицами.

Этот метод позволяет быстро и точно количественно оценить механику реполяризации, что может дать ценную информацию о клеточных ионных аномалиях. Ярко выраженные особенности первой фазы могут наблюдаться в оптических сигналах от кардиомиоцитов мышей, которые морфологически отличаются от таковых индуцированных плюрипотентных кардиомиоцитов человека, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Кроме того, индуцированные плюрипотентными стволовыми клетками кардиомиоциты человека реагируют на фармакологические манипуляции с нифедипином, известным антагонистом кальциевых каналов L-типа.

При непрерывном применении препарата наблюдалось снижение длительности потенциала действия на 41,5% при 90% реполяризации, что свидетельствует о функциональности визуализации на основе флуоресцентного индикатора напряжения в качестве платформы для проспективных высокопроизводительных исследований скрининга кардиологических препаратов. Важно иметь в виду, что, хотя чувствительный к напряжению краситель, используемый в этом исследовании, менее цитотоксичен, чем другие, возбуждающий свет все же следует использовать умеренно для сохранения жизнеспособности клеток. Оборудование для модуляторной фотометрии, используемое в этом протоколе, невероятно универсально.

Например, его можно использовать для одновременных измерений других электрофизиологических параметров, таких как внутриклеточный кальций.