Time-Resolved Флуоресценция Изображения и анализ вторжения раковых клеток в 3D-модель сфероидов

Этот протокол может быть использован для изучения механизмов, регулирующих вторжение раковых клеток во внеклеточную матрицу в режиме реального времени. Основным преимуществом этой техники является то, что он использует простое устройство сфероидной визуализации, что делает анализ нашествия сфероидов легче настроить и повышает его эффективность и стоимость. В то время как мы демонстрируем использование сфероидной нашествия анализ для моделирования молочной карциномы, этот анализ является отличной моделью для вторжения любой твердой опухоли в окружающие здоровые ткани.

После 3D-печати спейсера, вес из 10:1 соотношение базового полимера к кросс-linker в пластиковый стаканчик и использовать одноразовые пипетки тщательно перемешать в результате PDMS решение в чашке. Поместите чашку в вакуумную камеру и быстро отпустите вакуумное давление, чтобы удалить любой воздух, захваченный на поверхности смеси и рассеять оставшиеся пузырьки воздуха. Инкубировать 3D печатный спейсер при 100 градусах по Цельсию в течение пяти минут, чтобы увеличить свою гибкость и очистить две стеклянные пластины со 100%изопропанолом.

Поместите пространство так, что это заподлицо между двумя очищенными пластинами и поместите два больших зажима связующего на нижнем краю и один на верхний угол, чтобы запечатать плесень на внешние края пластин. Осмотрите верхнюю часть формы, чтобы убедиться, что спейсер заподлицо со стеклянными пластинами и использовать одноразовые пипетки с примерно два сантиметра вырезать из кончика медленно, но постоянно добавлять смесь PDMS в левый верхний угол формы. Когда вся плесень была заполнена, поместите плесень в вакуумную камеру, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, которые сформировались, прежде чем лечить PDMS в течение одного часа при 100 градусах по Цельсию.

В конце инкубации поместите форму при комнатной температуре. Когда это прохладно на ощупь, удалить связующие клипы и стеклянные пластины из спейсера, содержащего вылечить PDMS и использовать лезвие бритвы, чтобы прорезать печать, которая была создана на всех четырех сторонах формы между спейсером и стеклянной пластины. Потяните друг от друга плесень, чтобы выявить лист PDMS в spacer и использовать пинцет, чтобы тщательно очистить лист PDMS от спейсера.

Поместите лист на режущей коврик и используйте пунш биопсии, чтобы пробить диск PDMS диаметром 17,5 миллиметра, а затем пробить три равномерно распределенных отверстия 5,5 миллиметра в диск. Используйте ленту, чтобы удалить частицы пыли из каждой вставки и придерживаться очищенных вставок на кусок односторонней ленты. Оберните ленту вокруг крышки 10-сантиметровой чашки Петри и поместите крышку в плазменную машину вместе с открытыми 35-миллиметровыми стеклянными нижней посудой.

Активируйте вставки и стекло с одной минутой плазменной обработки на 300 миллиторов и используйте пинцет, чтобы быстро прикрепить обработанную сторону каждой вставки к стеклянной части одной обработанной стеклянной нижней тарелки на вставку. Когда все вставки были применены, используйте указательный палец и большой палец, чтобы применить равномерное давление на каждую вставку во время вращения блюда, чтобы надежно прикрепить вставки к посуде. Когда все вставки были защищены, инкубировать в результате сфероидных изображений устройств в течение 20 минут при 60 градусов по Цельсию, прежде чем выполнять второй раунд плазмы лечения, как показано.

После второй обработки добавьте 35 микролитров свежеприготовленного раствора покрытия к каждому отверстию вставки. После одного часа при комнатной температуре снимите раствор покрытия и трижды промойте устройство дистиллированной водой. После последней стирки добавьте 35 микролитров кросс-связывающего раствора в каждое отверстие для 30-минутной инкубации при комнатной температуре.

В конце инкубации, промыть устройство три раза дистиллированной водой, как попродемонстрировано, прежде чем заполнить каждое устройство с 70% этанола для 30-минутной инкубации под ультрафиолетовым светом. В конце стерилизации, промыть устройства три раза дистиллированной водой и добавить 2,5 миллилитров раствора для хранения для каждого устройства. Чтобы встроить сфероиды в коллаген, мыть устройства три раза с тремя миллилитров PBS за стирку.

После последней стирки, дайте устройствам полностью высохнуть, прежде чем добавить один сфероид в 30 микролитров свежеприготовленного колледжа один раствор в одно отверстие вставки и запуск таймера. Подтвердив наличие сфероида в отверстии, добавьте сфероиды к двум другим отверстиям, как это было продемонстрировано. Используйте 10 микролитр пипетки отзыв для последние любые сфероиды, которые расположены близко к границе PDMS, или отделить сфероиды, если несколько сфероидов распределяются и остановить таймер.

Чтобы вертикально центрировать сфероид в коллагеновом слое, после посева переверните устройство вверх дном и инкубируйте устройство при 37 градусах до тех пор, пока коллаген не полимеризируется, обратив ориентацию устройства каждые две минуты в общей сложности на 30 минут, затем добавьте 2,5 миллилитров среднего на устройство и приобретете изображение сфероидов в точке нулевого часового времени. Использование сфероидного изображения устройства облегчает эффективное встраивание и промежуток времени записи вторжения раковых клеток в коллагене или с помощью продольной визуализации. Хотя этот сфероид был изображен продольно в течение шести дней, требующих стабильного выражения цитоплазмических и / или ядерных флуоресцентных белков, аналогичные продольные изображения могут быть выполнены в течение более короткого периода времени с использованием красителя маркировки.

Сфероиды также могут быть исправлены и immunolabeled. Например, эти сфероиды были иммунолабелированы для эпителиально-кадерин, кортактин, и F-актин. На этих снимках можно наблюдать пошаговую иллюстрацию процедуры обработки изображений с использованием макроса Фиджи для измерения области сфероида с течением времени.

Обязательно раздай один сфероид в каждое отверстие сфероидного устройства визуализации и распоистит сфероид в центре отверстия в обоих направлениях XY и q. Конструкция устройства может быть легко изменена путем изменения размера и расположения отверстий, вставок и стеклянной нижней посуды для размещения более высокой пропускной способности сфероида.