Улучшенный анализ и инструменты для измерения механического ноцицепции в Drosophila Larvae

Этот протокол важен, потому что он позволяет пользователю создать инструмент, который может быть использован для точного измерения механических реакций ноцицепции у генетически поддающихся лечению личинок дрозофилы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует простые материалы для создания пользовательских инструментов, которые можно использовать для измерения механической ноцицепции от подпорогового до полностью чувствительного диапазона. Эти инструменты и методы могут быть использованы для измерения исходной механической ноцицепции и ноцицептивной сенсибилизации после травмы или заболевания.

Зондирование личинок с помощью нестандартных нитей требует практики. Пользователи должны иметь возможность создавать кривые «доза-реакция» с контрольными личинками перед попыткой проведения эксперимента. Чтобы сконструировать механический щуп, используйте небольшой кусачок, чтобы разрезать каждую нитиноловую нить на заданную длину перпендикулярно ее длинной оси.

Нити накаливания бывают трех различных предустановленных диаметров. Исследуйте кончик нитей под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что не осталось острых или неровных краев, которые могли бы вызвать повреждение тканей кожи личинки и помешать калибровке. Затем с помощью точильного камня вручную сгладьте края щупа до тех пор, пока не исчезнут острые неровности.

Затем с помощью иглы для подкожных инъекций проткните отверстие рядом с концом деревянной палочки от мороженого. Нанесите древесный клей на одну нить нитинола и вставьте покрытую клеем нить в паз для иглы. Когда клей высохнет, прижмите щуп к шкале до тех пор, пока щуп не согнется, чтобы определить максимальную силу, которую можно записать в граммах.

Используйте формулу для преобразования записанной массы в силу в миллиньютонах. Затем разделите измеренную силу на площадь поверхности наконечника нити, чтобы перевести рассчитанную силу в килопаскаль давления. Подготовка нескольких зондов с использованием нитей разного диаметра и длины позволит создать полный набор, охватывающий диапазон чувствительности личинок дрозофилы.

Чтобы подготовить личинки дрозофилы к эксперименту, выращивайте личиночное потомство на стандартной пище в инкубаторе при температуре 25 градусов Цельсия в течение примерно 96 часов. Когда личинки достигнут третьей стадии стадии, приготовьте пробку из корма для мух в маленькой чашке Петри для личинок, которые будут протестированы, и с помощью щипцов аккуратно отсортируйте личинок среднего размера среднего третьего возраста от меньших личинок второго и раннего третьего возраста и более крупных личинок позднего или блуждающего третьего возраста. Затем с помощью щипцов пересадите от 20 до 30 личинок среднего третьего возраста в маленькую чашку Петри, содержащую небольшую пробку из корма от мух, смоченную водой комнатной температуры.

Чтобы провести механический анализ ноцицепции, с помощью щипцов поместите личинку середины третьего возраста на темную тонкую виниловую прокладку под стереомикроскопом Brightfield и расположите оптические волокна между линзами объектива микроскопа и прокладкой. Используйте бумажное полотенце, чтобы вытереть лишнюю воду вокруг личинки, и переместите подушечку, чтобы направить голову и рот личинки к недоминирующей руке исследователя. Выберите механический зонд и приложите зонд к задней дорсальной стороне личинки примерно в брюшном сегменте А8 в течение одной-двух секунд, осторожно сжимая личинку в нижележащую прокладку в точке контакта с зондом до тех пор, пока зонд не согнется и не вызовет ранее измеренное давление.

Положительный ноцицептивный ответ указывается в том случае, если личинка демонстрирует полный штопор на 360 градусов по оси своего тела в течение трех секунд. Запишите поведенческую реакцию каждой личинки. Затем отбраковывают проверенную личинку и подготавливают следующую личинку к анализу.

Эти специализированные механические зонды с нитинальными нитями могут быть использованы для выявления механически вызванного поведения и создания полной поведенческой кривой доза-реакция с использованием как безвредных, так и вредных механических зондов различной интенсивности. Как показывают эти результаты поведенческого анализа, зонды, оказывающие давление 200 килопаскаль или менее, не вызывают аверсивной реакции перекатывания у личинок дрозофилы. Как и ожидалось, эти подпороговые или безвредные механические зонды не вызывают видимого повреждения нервной ткани.

И наоборот, сверхпороговые или вредные зонды вызывают усиленную поведенческую реакцию, а также повреждение тканей самих периферических сенсорных нейронов дозозависимым образом. Эти зонды также могут использоваться для измерения механической гиперчувствительности после травмы. Примерно 20% личинок реагируют на аверсивное перекатывание уже через два часа после УФ-обработки, в то время как 50% реагируют на четыре часа по сравнению с животными, облученными УФ-излучением.

Поскольку зонд, используемый для этого анализа, обычно имел пороговое значение 200 кПа, этот ответ был расценен как механическая аллодиния. В более поздние моменты времени поведенческая реакция личинок, обработанных ультрафиолетом, немного усиливается, но статистически не отличается от таковой у контрольной группы, подвергшейся имитационному облучению. Личинки, исследованные с помощью зонда мощностью 462 килопаскаль через 4, 8 и 16 часов после УФ-обработки, демонстрируют значительное увеличение аверсивной реакции перекатывания, причем 4 часа являются пиком поведенческой гиперчувствительности, поскольку стимул изначально был вредным.

Реакцией считалась механическая гипералгезия. Подготовка зонда, а также отбор и сжатие личинок имеют решающее значение для успеха процесса. С помощью этих зондов можно измерить исходный уровень ноцицепции, а механическую ноцицептивную гиперчувствительность можно измерить после травмы.

Используя эти инструменты и анализы, молекулярные и генетические основы механической ноцицепции и ноцицептивной гиперчувствительности могут быть измерены в генетически поддающейся лечению модели дрозофилы.