Электро-поле индуцированной нейронной дифференциации клеток-предшественников в микрофлюидных устройств
14 апреля 2021 г.
В этом исследовании мы представляем протокол дифференциации нервных стволовых клеток и клеток-предшественников (NPC), индуцированных только стимуляцией импульса прямого тока (DC) в микрофлюидной системе.
Это исследование представляет собой протокол для дифференциации нейронных клеток-предшественников исключительно индуцированных стимуляцией прямого тока импульса в микрофлюидной системе. Этот метод обеспечивает полезный подход для сокращения экспериментального времени установки, объема выборки и объема реагентов. Кроме того, чип МЧС подходит для наблюдений за конфокальцией.
Простое лечение прямого тока импульса может контролировать мышь нервных клеток-предшественников и может быть использован для разработки терапевтических стратегий для расстройства нервной системы. Для начала нарисуйте шаблоны для отдельных слоев PMMA и двустороннюю ленту с использованием соответствующего программного обеспечения. Включите лазерный писец углекислого газа и подключите его к персоному компьютеру.
Откройте разработанный файл шаблона с помощью программного обеспечения. Поместите листы PMMA или двустороннюю ленту на платформу лазерного писца, затем сосредоточьте лазер на поверхности листов PMMA или двустороннюю ленту с помощью инструмента автофокусировки. Выберите лазерный писец в качестве принтера, а затем используйте лазерный писец, чтобы начать прямую абляцию на листе PMMA или двустороннюю ленту.
Снимите защитную пленку с листов PMMA и очистите поверхность с помощью азотного газа. Для склеивания нескольких слоев листов PMMA, стек три куска одного миллиметра PMMA листов и склеить их под давлением пять килограммов на квадратный сантиметр в тепловой связующий в течение 30 минут при 110 градусах по Цельсию, чтобы сформировать поток или электрической стимуляции канала сборки. Придерживайтесь 12 частей адаптеров к отдельным отверстиям в слое один из МО чип сборки с быстро действующим цианоакрилатом клея.
Дезинфицировать один миллиметр PMMA субстраты, двусторонняя лента, и три миллиметра оптического класса PMMA с помощью ультрафиолетового облучения в течение 30 минут до сборки чипа. Придерживайтесь одномиллиметровых субстратов PMMA на трехмиллиметровой оптической ПММА с двухсторонней лентой для завершения сборки PMMA. Придерживайтесь очищенного стеклоочистительного стекла к сборке PMMA с помощью двухсторонней ленты.
Печать отверстия адаптеров агар моста с белыми пальцами герметики пробки. Подключите плоский нижний разъем к сборке чипов MOE через средние входные и розетки адаптеры, а затем подключить конус Luer адаптер к трех-путь стопкоков. Добавьте два миллилитров раствора 0,01%PLL с помощью трехмиллилитрового шприца, который подключается к трехмерной стопкок среднего входе, и подключите пустой трехмиллилитровый шприц к трехмерной стопкок средней розетки.
Заполните области клеточной культуры раствором PLL и медленно перекачиваем раствор покрытия туда-сюда. Закройте два трехголохолки, чтобы запечатать решение внутри культурных регионов. Инкубировать чип МЧС при 37 градусах по Цельсию за ночь в инкубаторе, наполненном 5%-ным углекислым газом.
Откройте два трехкую стороны стопкоков и смыть пузырьки в каналах вручную накачки покрытия раствор взад и вперед в канале с помощью двух шприцев. Нарисуйте три миллилитров полной среды в трехмилитрный шприц, который соединяется с трехмерным стопкоком среднего входного и добавьте его, чтобы заменить раствор покрытия в регионах клеточной культуры. Замените белую вилку с адаптером Luer и ввезу 3%hot agarose для заполнения адаптера.
Подключите шприц блокировки Luer к адаптеру Luer и ввезу 3%hot агарозу через черный резиновый бонг, чтобы заполнить шприц замка Luer. Разрешить от 10 до 20 минут для агарозы, чтобы остыть и затвердеть. Установите чип MOE, посеянный на прозрачном нагревателе ITO, который крепится на программируемой моторизованной ступени XY, которая поддерживается при 37 градусах цельсия.
Наполнить mNPCs вручную накачки в чип МЧС через средний выход, а затем инкубировать ячейки семенами ЧИП МЧС на обогреватель ITO в течение четырех часов. Используйте электрические провода для подключения мультиплексера EF к чипу MOE с помощью электродов на чипе. Подключите мультиплексер EF и генератор функций к усилителю для вывода импульсов квадратной волны DC.
Удалите все плоские нижние разъемы и адаптеры на чипе MOE и заполните адаптеры с ПОМОЩЬю PBS, затем запечатав отверстия адаптера парафильмом. После иммуностиммента наблюдайте за клетками с помощью конфокального флуоресцентных микроскопов. Стимуляция импульса DC привела к одновременному дифференциации мНПЦ на нейроны, астроциты и олигодендроциты в среде обслуживания стволовых клеток.
Процент нейронов, астроцитов и олигодендроцитов в контрольной группе и в группе стимуляции показаны здесь. После лечения пульса DC, mNPCs выразили значительно большое количество нейронов на DIV семь, астроциты на DIV три, и олигодендроциты на DIV семь и DIV 14 присутствовали на относительно более высоких уровнях в группах стимуляции, чем в контрольной группе. Нейросферы, образованные от 30 до 40 клеток, предпочтительнее для инициирования дифференциации mNPC.
Разрастание мНПЦ ухудшит выживаемость клеток в процессе дифференциации.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол дифференцировки нейральных клеток-предшественников, индуцированной стимуляцией импульсным постоянным током в микрофлюидной системе. Этот метод позволяет сократить время подготовки эксперимента, объем образцов и расход реагентов, что делает его эффективным для исследовательских целей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Микрофлюидика
Теоретическая часть
- Нейральные клетки-предшественники (NPCs) имеют решающее значение для понимания развития нервной системы.
- Стимуляция импульсами постоянного тока может влиять на судьбу клеток.
- Микрофлюидные системы позволяют точно контролировать условия эксперимента.
- Этот подход может помочь в разработке методов терапии заболеваний нервной системы.
Цель исследования
- Разработка надежного протокола дифференцировки NPC.
- Использование стимуляции постоянным током в качестве метода контроля судьбы клеток.
- Демонстрация эффективности микрофлюидной системы в нейробиологических исследованиях.
Используемые методы
- Проектирование шаблонов для слоев ПММА и двусторонней клейкой ленты.
- Использование лазерного гравера с CO₂ для изготовления.
- Применение импульсной стимуляции постоянным током для НПК.
- Проведение наблюдений с помощью конфокальной микроскопии для анализа.
Основные результаты
- Успешная дифференцировка НПК с использованием предложенного протокола.
- Сокращение времени подготовки экспериментальной установки и использования ресурсов.
- Возможность использования чипа MOE для микроскопии.
- Потенциальное применение в терапевтических стратегиях лечения заболеваний нервной системы.
Выводы
- Данный протокол предлагает упрощенный подход к дифференцировке NPC.
- Стимуляция постоянным током эффективна для контроля судьбы клеток.
- Микрофлюидные системы повышают эффективность экспериментов в нейронауке.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данная микрофлюидная платформа обеспечивает точный контроль дифференцировки нейральных клеток-предшественников с помощью стимуляции импульсами постоянного тока, представляя собой масштабируемую и ресурсоэффективную модель для валидации мишеней в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. За счет снижения сложности экспериментов и расхода реагентов она способствует раннему снижению рисков при изучении механизмов и повышает прогностическую достоверность стратегий модуляции судьбы клеток. Совместимость системы с длительной стимуляцией и автоматизированной визуализацией позволяет интегрировать ее в рабочие процессы по поиску новых терапевтических средств для лечения нервной системы.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать электрические сигналы как регуляторы судьбы нейральных клеток-предшественников, что способствует проверке гипотез о воздействии на конкретные мишени в путях нейроразвития.
- Операционная ценность: сокращает объемы образцов и реагентов за счет микрофлюидного ограничения, что снижает затраты при проведении ранних кампаний по скринингу мишеней.
- Прогностическая ценность: обеспечивает количественную оценку нейрональной, астроцитарной и олигодендроцитарной дифференцировки, что позволяет принимать обоснованные данные решения о целесообразности дальнейшей работы с модулирующими мишенями.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные, воспроизводимые результаты дифференцировки при контролируемых параметрах электрического поля, что подходит для оптимизации анализа.
- Практическая ценность: облегчает мультиплексное тестирование условий благодаря многоканальным конструкциям, что повышает пропускную способность при оценке соединений или стимулов.
- Готовность к анализу: поддерживает длительное культивирование и таймлапс-визуализацию, что позволяет проводить кинетический профилинг динамики дифференцировки для валидации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: использование нейральных клеток-предшественников мыши в определенной микросреде повышает релевантность процессам нейральной дифференцировки in vivo.
- Доклиническое моделирование: поддержка получения глиальных и нейрональных линий из общего предшественника, что полезно для моделирования заболеваний нервной системы.
- Оценка с учетом рисков: возможность оценки смещения дифференцировки при стимуляции, что позволяет формировать профили безопасности и эффективности на механистическом уровне.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска, в частности, на стадиях валидации мишеней и идентификации соединений-лидеров, где критически важно понимание механизмов работы регуляторов клеточной судьбы. Он поддерживает кампании по скринингу, предоставляя контролируемую и количественно определяемую систему для оценки биологической активности электрических или фармакологических модуляторов. Результаты работы платформы — метрики дифференцировки, специфичные для конкретных клеточных линий — поступают в аналитические конвейеры, используемые для приоритизации мишеней с прогностической уверенностью в механизмах восстановления нейронов.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез о путях биоэлектрической сигнализации в клетках-предшественниках нейронов, уменьшая неопределенность в определении целевого механизма.
- Скрининг: позволяет проводить воспроизводимые количественные анализы дифференцировки при определенной электрической стимуляции, повышая надежность анализа.
- Аналитика: обеспечивает измеримые конечные точки (например, % нейронов, астроцитов, олигодендроцитов) для сравнительного анализа различных условий.
- Трансляционные исследования: моделирует динамику дифференцировки, имеющую значение для расстройств нервной системы, поддерживая непрерывность доклинических исследований.
- Корпоративное повторное использование: разработан для многократного использования в различных экспериментальных условиях, что способствует стандартизации и согласованности данных между проектами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишеней за счет выделения электрической стимуляции в качестве определенной переменной, влияющей на определение судьбы клеток.
- Практическая ценность: стандартизирует протоколы дифференцировки благодаря точности микрофлюидики, что повышает воспроизводимость результатов в различных центрах и исследовательских группах.
- Стратегическая ценность: ускоряет принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), предоставляя ранние механистические данные о коммитировании клеточных линий, что снижает риск неудач на поздних этапах.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию мишеней, модулирующих нейрональную дифференцировку, с учетом рисков, что повышает эффективность использования капитала в портфелях нейробиологических исследований.
Особенности реализации
- Требуется опыт в сборке микрофлюидных устройств, электрофизиологии и культивировании нейральных стволовых клеток.
- Необходим доступ к инструментам лазерного изготовления, нагревателям из ITO, мультиплексорам EF и системам инвертированной микроскопии.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима стандартизация электрических параметров (длительности импульса, частоты, амплитуды) во всех экспериментах.
- Адаптация метода для использования нейральных клеток-предшественников человека может потребовать оптимизации параметров стимуляции и условий культивирования.
- Долгосрочная стабильность электродов и биообрастание при исследованиях с хронической стимуляцией представляют собой практические ограничения, которые следует учитывать.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:46
Design and Fabrication of the Multichannel, Optically Transparent, Electrotactic Chip and Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions
2:49
Coating Poly-L-lysine on the Substrate in the Cell Culture Regions and Preparation of the Salt Bridge Network
4:47
Setup of the Microfluidic System for DC Pulse Stimulation
5:55
Results: Differentiation of the mNPC Cells in the Control Group and in the DC Pulse Stimulation Group at DIV 3, 7, and 14
6:43
Conclusion
