Региональное рассечение мозжечка для молекулярного анализа

Традиционные молекулярные исследования мозжечка проводились на экстрактах цельного мозжечка, которые могут скрывать любые различия между конкретными областями мозжечка. Этот протокол позволяет оценить отдельные области мозжечка по отдельности и позволяет исследовать молекулярные механизмы, которые могут лежать в основе их уникального вклада в различные модели поведения и прогрессирование заболевания. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет воспроизводить и быстро рассекать четыре области мозжечка, глубокие ядра мозжечка, переднюю и заднюю кору мозжечка червей и кору мозжечка полушарий.

Обезглавив усыпленную мышь, сделайте надрез лезвием бритвы вдоль медиальной сагиттальной линии головы, начиная с носа и продолжая до самого конца. Отделите кожу и с помощью лезвия бритвы отрежьте мышцы с каждой стороны, разрезая мимо ушных каналов. С помощью ножниц для препарирования обрежьте многие участки спинного мозга до места, где ствол мозга встречается с мозжечком, стараясь не повредить мозжечок.

Вставьте одно из лезвий сосудистых ножниц в пространство между стволом мозга и позвоночником и разрежьте по направлению к ушному каналу, поднимая вверх во время разрезания, чтобы ограничить повреждение тканей. Продолжайте резать вдоль края черепа вверх по направлению к обонятельным луковицам. С помощью тупых щипцов аккуратно снимите заднюю часть черепа, чтобы открыть заднюю область мозга и мозжечок.

Расположите тупые щипцы вдоль разрезанного края черепа и отклейте череп вверх и над мозгом. Обрежьте остальную часть черепа сосудистыми ножницами и тупыми щипцами, очистив большую его часть от верхней части мозга. Слегка приподнимите мозг с помощью микрошпателя, чтобы удалить обонятельные луковицы из оставшегося черепа и отсоединить волокна зрительного тракта.

В этот момент мозг должен легко освободиться. Поместите мозг в чашку Петри, сидя на льду, и удалите оставшийся череп или другой мусор. Аккуратно поместите мозг в мозговую матрицу тыльной стороной вверх.

Убедитесь, что она установлена на уровне матрицы и что средняя линия находится в центре. Поместите одно лезвие бритвы вдоль сагиттальной средней линии, следя за тем, чтобы лезвие давило до самого низа матрицы. Поместите еще одно лезвие бритвы на один миллиметр в сторону от первого лезвия.

Поместите еще два лезвия, в результате чего три лезвия будут расположены на одной стороне мозга, все на расстоянии одного миллиметра друг от друга. Повторите это с другой стороны. Осторожно возьмитесь за передний и задний конец лезвий бритвы и поднимите их прямо вверх из матрицы.

Выбросьте салфетку с внешней стороны лезвий бритвы. Медленно отделяйте одно лезвие бритвы от остальных, стараясь не повредить участки ткани. Сдвиньте срез ткани с лезвия бритвы на предметное стекло с помощью микрошпателя.

Следует собрать шесть сагиттальных отделов мозга. На передних боковых секциях будет видна DCN. Чтобы изолировать DCN, держите кончик пипетки объемом 200 микролитров перпендикулярно DCN и надавливайте вниз через ткань, сильно покачиваясь во всех направлениях.

Поднимите пипетку вверх и визуально подтвердите наличие ткани в наконечнике. Поместите один палец в верхнюю часть кончика и надавите вниз, в результате чего ткань выпячивается. Вставьте наконечник в правильно маркированную микрофишную пробирку и убедитесь, что тканевый дырокол находится на дне пробирки.

Повторите то же самое для остальных трех секций, поместив пуансоны DCN в ту же трубку. Мгновенно заморозьте трубку в жидком азоте. Оттолкните остальную мозговую ткань вокруг мозжечка в тех участках, где был извлечен DCN.

С помощью тупых щипцов аккуратно возьмите эти участки коры полушария мозжечка и поместите их в соответствующие микрофиши, а затем заморозьте их. Для последних двух чермевых срезов оттолкните окружающие ткани мозга, чтобы оставить только мозжечок. С помощью лезвия бритвы сделайте надрез, отделяющий передние половые губа от задних.

Следите за тем, чтобы разрез был сразу после формирования губной шестерки и не включал в себя 10 губ. С помощью тупых щипцов осторожно поместите передние участки коры мозжечка и задние участки коры мозжечка в соответствующие микрофиши и мгновенно заморозьте их, оставив пробирки в жидком азоте на пять минут. Поместите микрофиши на лед, чтобы ткань не оттаяла слишком быстро, и нанесите 150 микролитров холодного раствора для выделения РНК в микрофишу, затем гомогенизируйте стерилизованным пестиком.

После гомогенизации ткани пипеткой подавайте раствор вверх и вниз, чтобы убедиться, что не осталось неповрежденной ткани. Кроме того, разбейте любые мелкие кусочки ткани, несколько раз втянув их в инсулиновый шприц. Добавьте еще 350 микролитров реагента, пипеткой вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать, и оставьте при комнатной температуре на пять минут.

Добавьте в тюбик 150 микролитров хлороформа и энергично встряхните его, затем дайте отдохнуть две-три минуты. Центрифугируйте при 12 000 умноженных на G при 15 градусах Цельсия в течение 10 минут. Осторожно извлеките пробирки из центрифуги и установите температуру центрифуги на четыре градуса Цельсия.

Перенесите в новую пробирку только прозрачную водную фазу, стараясь не нарушить непрозрачную интерфазу. Сохраните или выбросьте оставшийся раствор в пробирках. Добавьте 100% изопропиловый спирт в соотношении один к двум и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.

Дайте образцу отдохнуть при комнатной температуре в течение 10 минут, чтобы РНК выпала в осадок из раствора. Центрифугируйте при температуре 12 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, размещая все пробирки в одной ориентации, чтобы облегчить визуализацию гранулы. После центрифугирования осторожно извлеките пробирки и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, следя за тем, чтобы не нарушить действие гранулы.

Гранула имеет гелеобразную форму и ее трудно увидеть, поэтому оцените, где она находится, основываясь на ориентации пробирок в центрифуге. После удаления всей надосадочной жидкости добавьте 500 микролитров 75%-ного этанола, кратковременно перемешайте и центрифугируйте при температуре 7,500 раз G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Удаляйте надосадочную жидкость аккуратно, не нарушая гранулы.

Оставьте крышки открытыми, чтобы образец высох в течение пяти-10 минут. После высыхания суспендируйте гранулу в свободной воде ДНК в количестве 20 микролитров для образцов DCN и 30 микролитров для всех остальных. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего анализа.

Этот протокол был использован для препарирования четырех различных областей мозжечка мыши и изучения региональных различий в экспрессии генов. Уровни экспрессии альдолазы С, парвальбумина и KCNG4 оценивали с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Альдолаза C более сильно экспрессируется в задней части червей мозжечка.

Но ниже в ДЦН и передней области червей по сравнению с объемной диссекцией мозжечка. Парвальбумин аналогичным образом присутствует в передней черве DCN, задних червях и коре полушария мозжечка, по сравнению с объемными экстрактами мозжечка. KCNG4 значительно обогащен в DCN и внутренних червях, но не в задних червях или полушариях по сравнению с объемной экстракцией.

Чтобы напрямую сравнить экспрессию альдолазы С в коре мозжечка, уровни экспрессии сравнивали с передними червями. Уровень экспрессии альдолазы С был значительно выше в задних червивах и имел тенденцию к повышению в полушариях мозжечка. Выделенная из этих участков РНК также может быть использована в секвенировании РНК, экспериментах.

Сравнение секвенирования РНК для областей мозжечка дало бы более подробную информацию о молекулярных механизмах, лежащих в основе дискретных функций этих областей. А также потенциальные различия в их уязвимости к заболеванию.