Xenopus laevis Подготовка экстракта яйцеклеток и методы визуализации в реальном времени для визуализации динамической цитоплазматической организации
6 июня 2021 г.
Описан способ получения и живой визуализации неразбавленных цитоплазматических экстрактов из яиц Xenopus laevis .
Этот метод подходит для живой визуализации цитоплазматической динамики с использованием экстрактов яиц лягушки, что позволяет изучать пространственную информацию о паттерне в цитоплазме. Образцы могут быть сформированы в слой с равномерной и регулируемой толщиной и визуализированы в 2D-поле или 3D-объеме. Этот метод экономически эффективен и прост в реализации.
Начните с нанесения слоя клейкой ленты FEP на стеклянный слайд с помощью роликового аппликатора. Отрежьте лишнюю ленту по краям чистым лезвием бритвы. Далее таким же образом подготовьте ленту FEP с покрытием крышки.
Затем нанесите двустороннюю липкую прокладку для визуализации на сторону слайда, покрытую лентой FEP, оставив защитный вкладыш неочищенным. Переложите яйца в стеклянный стакан объемом 400 миллилитров и удалите как можно больше буфера для яйцекладки путем декантирования. Затем высиживают яйца в 100 миллилитрах свежеприготовленного раствора для дежелирования и аккуратно закручивают их.
Примерно через три минуты вылейте раствор и добавьте 100 миллилитров свежего раствора для обезжелезивания. Продолжайте инкубацию до тех пор, пока яйца не будут плотно упакованы, но не оставляйте яйца в растворе для обезжелезивания более пяти минут. После инкубации удалите раствор для обезжелезивания как можно больше и вымойте яйца в буфере 0,25x MMR.
Закрутите яйца, затем вылейте буфер. Повторите несколько раз, пока для стирки не будет использован в общей сложности один литр буфера. Затем вымойте яйца несколько раз с помощью в общей сложности 400 миллилитров буфера лизиса яиц, удаляя аномальные яйца между промывками.
Затем используйте передаточную пипетку с широким нарезанным наконечником, чтобы перенести яйца в 17-миллилитровую центрифужную трубку с круглым дном, содержащую один миллилитр буфера лизиса яиц. Раскрутите трубку в клинической центрифуге по 400 г в течение 15 секунд, чтобы упаковать яйца. Затем удалите как можно больше буфера лизиса яиц с помощью пипетки Пастера.
Определите примерный объем упакованных яиц. затем добавляют по пять микрограммов на миллилитр каждого апротинина, лейпептина и цитохалазина В и 50 мкг на миллилитр циклогексамида непосредственно поверх упакованных яиц. Раздавите яйца центрифуя трубку в течение 15 минут при 12 000 г и четырех градусах Цельсия в качающемся роторе ведра.
Затем прикрепите иглу 18 калибра к шприцу. Кончиком иглы, обращенным вверх, проколоть трубку со стороны на дне цитоплазматического слоя и восстановить экстракт, медленно рисуя. Перенесите восстановленный цитоплазматический экстракт в новую микроцентрифужную трубку и держите его на льду.
Когда вы будете готовы к изображению, дополните экстракт желаемыми реагентами и флуоресцентными зондами. Снимите верхний защитный вкладыш с распорки на подготовленном слайде и нанесите примерно семь микролитров экстракта в центр колодца. Немедленно нанесите покрытие с покрытием ленты FEP стороной FEP лицом к экстракту, чтобы загерметизировать скважину и быстро приступить к визуализации.
Установите затвор на перевернутый или вертикальный микроскоп с моторизованной сценой и цифровой камерой. Изображайте экстракты в нужных пространственных положениях во временных интервалах как в ярком поле, так и в флуоресцентных каналах. Здесь показан покадровый эксперимент с использованием экстрактов яиц xenopus laevis для изучения самоорганизации цитоплазмы во время интерфазы.
Примерно через 20 минут инкубации при комнатной температуре области, истощенные светорассеивающими цитоплазматическими компонентами, были видны как в ярком поле, так и в каналах митохондрий. Примерно к 60 минутам при комнатной температуре должна быть хорошо установлена пространственная картина, состоящая из клеточных отсеков с микротрубочками, образующими полую венокообразную структуру, и митохондриями, четко разделенными на каждый отсек. Здесь показано сравнение производительности экстракта в камерах визуализации с лентами FEP на стекле и без них.
В камере, изготовленной из заклеенного стекла FEP, экстракт самоорганизуется в нормальные клеточные узоры. В камере, где стеклянные поверхности не были покрыты лентой FEP, экстракт показывал аномальное яркое поле и микротрубочки, которые со временем становились все более нарушенными. Существенных различий в ядерном импорте белка GST-mCherry-NLS не наблюдалось.
Важно помнить, что стеклянные поверхности пассивируются лентой FEP и удаляют все плохие яйца во время приготовления экстракта. С помощью этой системы мы можем легко контролировать толщину образца экстракта, прокладывая путь для визуализации цитоплазматических узоров в 3D, используя микроскопию светового листа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен упрощенный метод подготовки и прижизненной визуализации неразбавленных цитоплазматических экстрактов из икринок Xenopus laevis. Эта методика позволяет изучать динамику цитоплазмы и развитие пространственных структур внутри нее, что способствует более глубокому пониманию клеточной организации.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Микроскопия
- Биология развития
Теоретическая часть
- Цитоплазматическая динамика имеет решающее значение для понимания организации клетки.
- Экстракты из икринок лягушки представляют собой подходящую систему для изучения этих процессов.
- Методы визуализации живых объектов расширяют возможности исследования пространственного распределения в цитоплазме.
Используемые методы
- Приготовление неразбавленных цитоплазматических экстрактов из икринок Xenopus laevis.
- Использование ленты из ФЭП для стабилизации образца во время визуализации.
- Визуализация живых объектов с применением флуоресцентных маркеров и светлопольной микроскопии.
Основные результаты
- Успешная визуализация самоорганизации в цитоплазматических экстрактах с течением времени.
- Формирование клетоподобных компартментов с определенными структурами микротрубочек.
- Сравнение эффективности визуализации в зависимости от обработки поверхности показало значительное влияние на организацию экстракта.
Выводы
- В исследовании описывается практический метод визуализации цитоплазматических структур и их динамики.
- Результаты расширяют наше понимание клеточных процессов и подчеркивают важность методов подготовки образцов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет осуществлять визуализацию динамики цитоплазмы в экстрактах яйцеклеток Xenopus laevis в режиме реального времени, предоставляя масштабируемую и экономичную систему для изучения процессов пространственного формирования паттернов и самоорганизации, имеющих значение для организации клетки. Благодаря отсутствию необходимости в химической обработке поверхности и использованию серийных расходных материалов, этот подход обеспечивает воспроизводимую визуализацию организации микротрубочек, ядер и митохондрий с высоким разрешением в контролируемой среде in vitro. Данный метод повышает достоверность прогнозов при механистических исследованиях поведения цитоплазмы, что способствует валидации мишеней на ранних этапах и разработке анализов в рамках процессов поиска новых лекарственных средств.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с механизмами цитоплазматической самоорганизации и пространственного паттернирования.
- Практическая ценность: способствует снижению биологических рисков путем визуализации динамической организации цитоплазмы в физиологически релевантной системе экстрактов.
- Трансляционный биомаркер: облегчает идентификацию динамических характеристик цитоплазмы, которые могут коррелировать с функциональными состояниями клеток.
Скрининг и разработка анализа
- Стандартизация анализа: обеспечивает воспроизводимую платформу для подготовки экстрактов с однородной толщиной и стабильностью за счет пассивации FEP-лентой.
- Количественные показатели: позволяет измерять динамику цитоплазмы и пространственную организацию с помощью таймлапс-визуализации в светлом поле и флуоресцентной микроскопии.
- Готовность к скринингу: представляет собой масштабируемую недорогую систему, совместимую с широкопольной и конфокальной микроскопией для оценки эффектов соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, релевантная заболеванию: служит механистической моделью для изучения консервативных цитоплазматических процессов, имеющих значение для деления и организации клеток.
- Прогностическая достоверность: способствует снижению рисков при выборе мишеней, участвующих в регуляции цитоскелета и пространственном структурировании, посредством прямой визуализации самоорганизации экстракта.
- Трансляционная преемственность: связывает результаты поисковых исследований с доклинической валидацией путем создания стабильной, пригодной для визуализации цитоплазматической модели.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум открытий: от раннего тестирования гипотез о мишенях до разработки анализа и доклинической валидации, особенно для мишеней, влияющих на динамику цитоскелета и субклеточную организацию.
- Биология открытий: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей, обеспечивая прямую визуализацию динамики микротрубочек и митохондрий в экстрактах интерфазных клеток.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной подготовки экстракта и стабильных условий визуализации без использования химической обработки поверхностей.
- Аналитика: позволяет получать количественные пространственные и временные данные об организации цитоплазмы, что делает возможным сравнительный анализ при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связаны с доклинической работой, предоставляя согласованную модель для изучения консервативных процессов клеточной организации.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую недорогую платформу для визуализации, которую можно адаптировать под различные мишени и кампании по скринингу.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неопределенности в исследованиях организации цитоплазмы.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость благодаря стандартизированной подготовке экстракта и пассивации поверхности с помощью ленты FEP.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшего развития проекта (go/no-go) за счет возможности ранней визуализации фенотипических эффектов на динамику цитоплазмы.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков, предоставляя сведения о механизмах действия соединений, влияющих на клеточную организацию.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с яйцами Xenopus, подготовки экстрактов и методами прижизненной визуализации.
- Необходим доступ к центрифугам, системам микроскопии (широкопольной/конфокальной), адгезивной ленте из FEP и спейсерам для визуализации.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов промывки яиц, удаления желеи и получения экстрактов.
- Адаптация к 3D-визуализации может потребовать интеграции с плоскостной световой микроскопией и оптимизации контроля толщины образца.
- Практические ограничения включают чувствительность к качеству яиц и необходимость удаления аномальных яиц во время подготовки для обеспечения однородности экстракта.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Preparation of Slides and Coverslips
1:06
Preparation and Live Imaging of Interphase-Arrested Egg Extracts
4:06
Result: Microscopy Analysis of Interphase-Arrested Egg Extracts Self-Organized into Cell-Like Compartments
5:23
Conclusion
