In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging для изучения миграции клеток к органу Корти

Существующий метод in vitro для исследования миграции МСК включает Transwell или протоколы заживления ран. Описанный здесь метод может быть использован для отслеживания миграции МСК в эксплант в режиме реального времени. С точки зрения культивирования экспланта, преимущество этого метода по сравнению с другими заключается в том, что он позволяет добиться сокращения времени и стоимости, а также упрощения экспериментальных этапов.

Этот метод может быть использован для наблюдения за самонаведением стволовых клеток на мишень в режиме реального времени, что приводит к разработке моделей с оптимизированной эффективностью самонаведения. Удаление текториальной мембраны представляет сложность для неопытных исследователей. В зависимости от стадии разработки, понимание правильного времени для удаления текториальной мембраны важно для успеха этого протокола.

Демонстрировать процедуру будут доктор Чон Ын Пак и Dr.Su Хун Ли, профессора-исследователи из моей лаборатории. Начните с стерилизации вытяжки для культуры тканей с ламинарным потоком, включив ультрафиолетовое излучение примерно на 30 минут. Перед использованием сбрызните все поверхности 70% этанолом и дайте им высохнуть.

Поместите инструменты для вскрытия в 70% этанол на 10 минут, затем высушите их перед использованием. Обезглавив мышь возрастом от трех до четырех дней, замочите переднюю часть в 70% этаноле и поместите ее под серийный микроскоп в ламинарный колпак. Быстро замочите ткань в растворе для рассечения тканей, чтобы удалить этанол.

Разрежьте центральную линию черепа хирургическим лезвием, затем обнажите череп, оттянув кожу спереди и разрезав наружный слуховой проход уха. Разрежьте черепную коробку от передней к задней части по линии глаз, затем вскройте череп и удалите передний мозг, мозжечок и ствол мозга тупыми щипцами. С помощью микрощипцов отделите улитку от височной кости и перенесите ее в чашку Петри, содержащую раствор для рассечения тканей.

Тщательно рассеките всю кохлеарно-глазную капсулу, оставив только внутренние мягкие ткани улитки. Удерживайте модиолус улитки щипцами и улитковый проток другой парой щипцов, затем медленно разделите две ткани. Удалите сосудистые полоски и текториальную оболочку, аккуратно отшелушивая их.

Поместите стерилизованную пластиковую покровную крышку в новый раствор для рассечения тканей, затем поместите орган Corti на покровную крышку, следя за тем, чтобы базилярная мембрана была обращена вниз. Иммобилизуйте ткань, прижав мембрану Рейсснера и оставшуюся ткань модиолуса к покровному стеклу с помощью щипцов. Перенесите покровную крышку со встроенной салфеткой в центр 35-миллиметровой конфокальной чашки.

Поместите стеклянный цилиндр для клонирования на чашку с кохлеарным эксплантом, расположенным в центре чашки, и добавьте в цилиндр 100 микролитров питательной среды для эксплантов. Поместите 5 000 мезенхимальных стволовых клеток, меченных GFP, или МСК из костного мозга в два миллилитра питательной среды за пределами стеклянного цилиндра и поместите чашку в инкубатор. После культивирования клеток, как описано в рукописи текста, аспирируйте всю среду внутри и снаружи цилиндра и извлеките стеклянный цилиндр из конфокальной чашки.

Добавьте в блюдо два миллилитра свежей питательной среды. Поместите его во влажный инкубатор до тех пор, пока он не будет готов к анализу. Используйте систему конфокальной микроскопии с топовым инкубатором.

Включите конфокальный микроскоп, флуоресцентный свет и компьютер. Установите условия работы инкубатора stage top на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в атмосфере. Поместите образец чашки на сосуд для крепления блюда, накройте его крышкой для крепления блюда и закройте камеру верхней крышкой нагревателя.

Отрегулируйте зум и фокусировку, чтобы локализовать орган корти и МСК в поле зрения. Откройте программу обработки изображений. В разделе «Найти» выберите 20-кратный план-апохроматический объектив или числовую апертуру 0,8 и область кадрирования 0,5X.

В разделе «Приобретение» нажмите «Умная настройка» и выберите EGFP. Откройте вкладку канала в разделе Захват и установите мощность лазера на 0,2%, точечное отверстие на 44 микрометра, мастер-усиление на 750 вольт и цифровое усиление на 1,0. Нажмите на ESID в разделе «Настройка изображения» и установите усиление ESID на четыре, а цифровое усиление на 7,5.

Нажмите на плитку и поставьте на кон, чтобы получить 210 плиток. Откройте стратегию фокусировки и выберите режим фокусировки. В разделе Временные ряды установите продолжительность 24 часа, а интервал — 10 минут.

В разделе «Захват» установите размер кадра 512 на 512 пикселей, скорость сканирования — восемь, направление — двунаправленное, усреднение — 4X, а количество бит на пиксель — 16. Нажмите на кнопку «Начать эксперимент», чтобы начать эксперимент. Двумерный путь мезенхимальных стволовых клеток или МСК отслеживался методом заживления ран с использованием стеклянного цилиндра в качестве барьера между МСК и органом корти.

Когда орган Corti культивировался, фибробласты очень быстро росли наружу из наружных волосковых клеток в самом внешнем слое. Большинство меченых GFP МСК были вытеснены быстрорастущими фибробластами. Тем не менее, некоторые из них проникли в слой фибробластов и успешно мигрировали в орган корти.

Результаты 72-часовой инкубации показали, что МСК мигрировали в орган корти и были локализованы в основном в модиолусе и области с отделенными от модиолуса волокнами кохлеарного нерва. Морфология МСК была изменена до радиальной формы, аналогичной форме нервных волокон. Клетки были преобразованы в линейную форму вдоль линии лимбуса, а не области волосковых клеток.

МСК были способны мигрировать и расти в области сбора нервных волокон, проникая через различные клеточные слои и физические барьеры. Когда повреждение волосковых клеток было вызвано 16-часовым лечением канамицином и клетки культивировались в течение последующих 72 часов после удаления канамицина, МСК локализовались не только в модиолусе, но и во внешних волосковых клетках. Важным этапом в этом протоколе является иммобилизация ткани, к которой прикрепляется кортиевый орган.

Он не отваливается легко. Это тривиальный, но полезный совет для успешной эксплантации культуры. Этот метод может быть адаптирован для изучения эффективности экзосом, секретируемых из МСК.