Функционализированный спироциклический гетероциклический синтез и анализ цитотоксичности
9 февраля 2021 г.
Здесь мы описываем биоанализ с использованием 3-(4',5'-диметилтиазол-2'-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (MTT) для тестирования ранее синтезированных спироциклических оксимов.
Этот протокол использует перерабатываемый и модифицированный метод получения спироциклических соединений. Анализ MTT помогает ответить на вопрос, касающийся цитотоксичности этих новых молекул. Этот метод производит новые модифицируемые молекулы с использованием регенерирующего исходного материала.
Анализ MTT обеспечивает относительно быстрые и простые для анализа биологические результаты Начните с выполнения твердофазного синтеза спироциклических гетероциклов шесть и семь, как было продемонстрировано ранее. Приготовьте 20 миллилитров пяти миллиграммов на миллилитр раствора МТТ, используя стерильный PBS в качестве разбавителя. Отфильтруйте и храните раствор при минус 20 градусах Цельсия.
Затем приготовьте один к одному разведение раствора МТТ в ДМЭМ. Готовят по одному миллилитру каждого из исходных растворов в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках исследуемых соединений в ДМСО. Храните их при минус 20 градусах Цельсия.
Готовят 200 микролитров на дозу рабочих растворов исследуемых соединений путем разбавления исходных концентраций. От одного до 1000 в свободной от сыворотки среде. В семенах тканевой культуры семь клеток COS в полной среде на плоской нижней тканевой культуре обрабатывали 96 пластин лунки в концентрации 4000 клеток на 200 микролитров на лунку.
Использование многоканального трубоукладчика. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. На следующий день аспирируйте супернатант из скважин с помощью стеклянной пастбищной пипетки, прикрепленной к вакуумному насосу.
Дозируйте клетки в трех экземплярах с исследуемыми соединениями, используя предварительно приготовленные рабочие растворы. Затем верните клетки в инкубатор. Через 24 часа аспирировать супернатант из скважин и добавить в каждую скважину 200 микролитров раствора МТТ.
Инкубируйте пластину в течение четырех часов. Осторожно аспирируйте супернатант из лунок, не нарушая фиолетовые кристаллы формазана. Добавьте 200 микролитров ДМСО в каждую лунку, чтобы растворить кристаллы.
Затем инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 15 минут. Измерьте поглощение для каждой скважины при 590 или 600 нанометрах с помощью считывателя пластин 96 скважин. Используйте скважины без ячеек в качестве фона и усредняйте значение поглощения.
Спироциклические гоксовые швы шесть и семь были синтезированы с использованием модифицированного протокола. Ход реакции контролировали путем обнаружения исчезновения альфа-бета-ненасыщенной Эстер с помощью инфракрасной спектроскопии. Анализ MTT использовался для определения жизнеспособности клеток.
Цисплатин, который, как известно, индуцирует гибель клеток при высоких концентрациях, служил положительным контролем. Как и ожидалось, чем выше концентрация цисплатина, тем ниже жизнеспособность клеток. Затем анализ MTT был использован для тестирования спироциклических соединений шесть и семь и фурфуриламин.
Фурфуриламин и спироциклический гоксовый шов шесть показали сходную цитотоксичность. Однако токсичность спироциклического соединения семь была заметно больше, чем у фурфуриламина и шести. При попытке этого протокола имейте в виду, что N-алкилирование, выполненное с использованием громоздких ацилгалогенидов, как было обнаружено, снижает скорость бета-элиминации, тем самым уменьшая выход продукта.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании описывается метод оценки цитотоксичности новых спироциклических оксимов с помощью МТТ-теста. В протоколе особое внимание уделяется синтезу в твердофазном модификаторе и оценивается жизнеспособность клеток COS7 после обработки синтезированными соединениями.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Биологические анализы
- Тестирование на цитотоксичность
- Синтез спироциклических соединений
Теоретическая часть
- Исследование спироциклических соединений
- Значение цитотоксичности в разработке лекарственных препаратов
- Использование МТТ-теста как надежного метода
Используемые методы
- Твердофазный синтез спироциклических гетероциклов
- Клеточная линия COS7 в качестве биологической модели
- МТТ-тест для измерения жизнеспособности клеток
Основные результаты
- Сравнение цитотоксических эффектов спироциклических соединений и фурфуриламина
- Результаты наблюдений показали, что спироциклическое соединение семь обладает более высокой токсичностью по сравнению с остальными
- Результаты подтверждены с использованием цисплатина в качестве положительного контроля
Выводы
- Исследование демонстрирует эффективность спироциклических соединений в индуцировании гибели клеток
- Результаты дают ценную информацию для исследований рака и разработки лекарственных препаратов
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
В данной работе представлен оптимизированный метод твердофазного синтеза спироциклических гетероциклов, позволяющий сократить количество этапов синтеза и исключить использование токсичных реагентов, что повышает эффективность поиска перспективных соединений при разработке противоопухолевых препаратов. МТТ-тест обеспечивает быстрый количественный скрининг цитотоксичности соединений в микромолярных концентрациях, что способствует валидации мишеней на ранних этапах и снижению рисков при изучении механизмов действия. В совокупности эти методы повышают прогностическую достоверность при приоритизации спироциклических каркасов для дальнейшей доклинической оценки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать цитотоксические эффекты новых спироциклических гетероциклов для оценки жизнеспособности терапевтической гипотезы.
- Операционная ценность: твердофазный синтез на смоле с линкером REM низкой плотности загрузки позволяет вводить объемные ароматические боковые цепи, что расширяет химическое разнообразие для исследований по взаимодействию с мишенью.
- Прогностическая ценность: данные о цитотоксичности, полученные с помощью МТТ-теста, позволяют принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) путем количественной оценки индукции гибели клеток относительно контроля с цисплатином.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: МТТ-анализ обеспечивает воспроизводимое колориметрическое определение жизнеспособности клеток COS7, обработанных исследуемыми соединениями.
- Практическая ценность: Коммерчески доступный МТТ-реагент и простой протокол обеспечивают совместимость с высокопроизводительным скринингом.
- Готовность анализа: Рабочие растворы, приготовленные в DMSO и разведенные в безсывороточной среде, гарантируют единообразную доставку соединений во всех повторностях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Профилирование цитотоксичности спироциклических соединений и фурфуриламина закладывает структурно-функциональную основу для последующей оптимизации.
- Доклиническая значимость: Наблюдаемая дифференциальная токсичность, в частности повышенная цитотоксичность спироциклического соединения семь, способствует идентификации ведущих соединений на основе анализа зависимости «структура-активность» (SAR).
- Механистическое снижение рисков: Использование цисплатина в качестве положительного контроля подтверждает чувствительность анализа и усиливает уверенность в специфических эффектах исследуемых соединений.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Интегрированный рабочий процесс, сочетающий твердофазный синтез с последующим скринингом цитотоксичности на основе MTT-теста, представляет собой связующее звено между этапом поиска и доклиническими исследованиями при оценке гетероциклических соединений в онкологии.
- Биология открытий: Твердофазный синтез позволяет быстро создавать модифицируемые спироциклические каркасы для проверки гипотез и изучения сигнальных путей.
- Скрининг: MTT-тест обеспечивает количественную конечную оценку жизнеспособности для сравнения активности и селективности соединений.
- Аналитика: Показатели абсорбции при 590–600 nm, нормированные по холостым лункам, предоставляют надежные данные для оценки IC50 при моделировании зависимости «структура-активность».
- Трансляционные исследования: Ранжирование соединений по цитотоксичности (например, соединение семь > шесть ≈ фурфуриламин) позволяет определить приоритеты для последующего изучения механизмов действия.
- Корпоративное повторное использование: Твердофазная платформа и MTT-тест адаптируемы для различных библиотек гетероциклов, что поддерживает создание многократно используемой инфраструктуры для новых открытий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Сокращение количества этапов синтеза и исключение токсичных реагентов повышают безопасность и масштабируемость маршрута для синтеза библиотек соединений.
- Операционная ценность: Смола с линкером REM с низкой степенью загрузки обеспечивает совместимость с объемными заместителями, что повышает вероятность успешного синтеза для различных хемотипов.
- Стратегическая ценность: Профилирование цитотоксичности ускоряет идентификацию активных спироциклических хитов, снижая риск потерь на поздних стадиях разработки.
- Влияние на портфель: Количественные данные о жизнеспособности клеток позволяют проводить приоритизацию спироциклических кандидатов с учетом рисков для их дальнейшей оптимизации методами медицинской химии.
Особенности реализации
- Для получения воспроизводимых результатов требуются навыки твердофазного органического синтеза и работы с культурами клеток.
- Оборудование включает планшетный ридер на 96 лунок с возможностью измерения абсорбции при 590–600 nm и ламинарный шкаф для стерильного дозирования соединений.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует единообразного приготовления раствора MTT, его хранения при –20°C и применения протоколов дозирования в трех повторах.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации плотности посева клеток и времени инкубации в зависимости от скорости пролиферации.
- Объемные ацилгалогениды на этапах N-алкилирования могут снижать скорость бета-элиминирования и выход продукта, как указано в протоколе.
![Твердофазный синтез [4.4] Оксимы Spirocyclic](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F58508.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A20.274Z&w=384&q=75)
