Заводская пробоподготовка для измерения содержания нуклеозидов/нуклеотидов с помощью ВЭЖХ-MS/MS
24 февраля 2021 г.
Здесь описан точный и воспроизводимый метод количественного определения in vivo нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Этот метод использует ВЭЖХ-МС/МС.
Нуклеозиды и нуклеотиды являются центральными метаболическими компонентами во всех живых организмах. Метаболизм их необходим для развития клеток. Этот подход обеспечивает мощный инструмент для количественной оценки этих метаболитов.
Этот метод позволяет быстро и точно количественно определять нуклеозиды и нуклеотиды в растениях. Полная предварительная обработка образцов и анализ LC-MS / MS занимают около двух дней для набора из 10-20 образцов. Этот метод можно применять ко всем растениям и даже другим организмам.
Продемонстрировать процедуру будет Чанхуа Чжу, адъюнкт-профессор из Лаборатории Чэнь. Чтобы вырастить растения, убедитесь, что семена Arabidopsis стерилизованы в 70% этаноле в течение 10 минут и посеяны на агаровых пластинах с питательными веществами 1/2 силы Murashige и Skoog. Высиживая пластины в темноте при четырех градусах Цельсия в течение 48 часов, затем перенесите их в контролируемую камеру роста под 16 часами света при 22 градусах Цельсия и восемью часами темноты при 20 градусах Цельсия.
Соберите 100 миллиграммов двухнедельной рассады и заморозьте их в жидком азоте для извлечения метаболитов. Измельчите 100 миллиграммов замороженных растительных тканей с семью-восемью стальными шариками в предварительно охлаждаемой смесительной мельнице в течение пяти минут с частотой 60 Гц. Готовят экстракционный раствор, который содержит метанол, ацетонитрил и воду в соотношении два к одному.
Повторное суспендируемые гомогенизированные материалы одним миллилитром экстракционного раствора. Центрифугируют полученный раствор при 12 000 XG в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, затем переложат 0,5 миллилитра суспензии в новую трубку объемом 1,5 миллилитра и заморозят в жидком азоте. Выпарить замороженный образец в сублимационной сушилке и повторно суспендировать его в 0,5 миллилитра 5% ацетонитрила и 95% воды.
Центрифугируют полученный раствор при 4 000 XG в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Загрузите супернатант во флакон для измерения LC-MS/MS. Приготовьте 10-миллимолярный буфер ацетата аммония, растворив 1,5 грамма ацетата аммония в двух литрах двойной деионизированной воды.
Отрегулируйте рН до 9,5 с 10% аммония и ацетатной кислоты. Подготовьте два литра сверхчистого 100% метанола для измерения нуклеозидов, затем подготовьте два литра сверхчистого ацетонитрила для измерения нуклеотидов. Впрыскиваем 0,02 миллилитра предварительно обработанной экстракции метаболита каждого ранее подготовленного образца в систему ВЭЖХ с бинарными насосами в сочетании с тройным четырехкратным масс-спектрометром.
Чтобы сгенерировать стандартные калибровочные кривые, объедините шесть извлечений образцов вместе и вихрьте смесь, а затем снова аликвотируйте ее до шести экстракций, чтобы получить каждый фон. Добавьте шесть различных концентраций каждого стандарта к этим шести экстракциям соответственно и вводите их одну за другой в систему ВЭЖХ. Регистрировать пиковые области каждого стандарта в разных концентрациях через массовые переходы.
Этот протокол использовался для идентификации и количественной оценки N1-метиладенозина, известного модифицированного нуклеозида, в двухнедельных саженцах дикого типа Arabidopsis. Профиль масс-спектрометрии показал, что ионы продукта, образующиеся из стандарта N1-метиладенозина, имеют соотношение 150 и 133 МЗ. И такой же профиль наблюдался в Колумбии нулевой добычи.
Из-за высокой обилия продукта-иона 150 МЗ для идентификации N1-метиладенозина был выбран массовый переход от 282,1 до 150. Время удержания целевого пика составило 7,05 минуты. Аналогично времени удержания стандарта N1-метиладенозина.
Серия концентраций стандартов N1-метиладенозина была добавлена в шесть образцов экстракции. Стандартные образцы вводили в LC-MS/MS, и увеличенные пиковые площади N1-метиладенозина были построены в сопоставлении с номинальными концентрациями стандартов. Шесть равных фоновых извлечений важны для создания точной и повторяемой калибровочной кривой для количественной оценки.
Наш метод может быть применен для изучения метаболических путей в растениях. Сравнивая профили метаболитов между мутантами дикого типа и мутантами с потерей функции, можно было бы вывести метаболический поток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается точный и воспроизводимый метод количественного определения нуклеозидов и нуклеотидов в растениях с помощью ВЭЖХ-МС/МС. Метод обеспечивает быстрый и точный анализ, что делает его применимым для различных организмов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Метаболизм растений
- Аналитическая химия
- Биохимия
Теоретическая часть
- Нуклеозиды и нуклеотиды необходимы для развития клеток.
- Точное количественное определение этих метаболитов имеет решающее значение для понимания метаболических процессов.
- Существующим методам может не хватать точности или воспроизводимости.
- В данной работе эти недостатки устранены с помощью надежного аналитического подхода.
Цель исследования
- Разработать надежный метод количественного определения нуклеозидов и нуклеотидов в образцах растений.
- Углубить понимание метаболизма растений.
- Предоставить инструмент, применимый для широкого спектра организмов.
Используемые методы
- Процедуры предварительной подготовки образцов.
- Метод ВЭЖХ-МС/МС для анализа.
- Обработка от 10 до 20 образцов в течение двух дней.
- Применение метода для различных видов растений.
Основные результаты
- Данный метод позволяет проводить быстрое и точное количественное определение.
- Метод воспроизводим для различных образцов.
- Результаты демонстрируют применимость метода к множеству организмов.
- Были получены значимые сведения о метаболизме нуклеозидов и нуклеотидов.
Выводы
- Данный метод представляет собой значительный прогресс в анализе метаболитов растений.
- Он может способствовать дальнейшим исследованиям метаболических путей.
- Будущие исследования могут расширить область его применения на другие биологические системы.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Количественное определение нуклеозидов и нуклеотидов в растительных системах имеет решающее значение для выяснения метаболических путей и подтверждения валидности мишеней на ранних этапах разработки. Данный рабочий процесс ВЭЖХ-МС/МС обеспечивает воспроизводимое абсолютное количественное определение, что позволяет уверенно сравнивать метаболические состояния различных генотипов или экспериментальных условий. Надежность и масштабируемость этого метода делают его базовым инструментом для снижения механистических рисков и проведения трансляционных исследований в рамках разработки биофармацевтических препаратов на растительной основе.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает точный количественный анализ нуклеозидных и нуклеотидных метаболитов для исследования метаболических путей.
- Поддерживает функциональную валидацию генетических или химических воздействий в моделях растений.
- Способствует снижению механистических рисков за счет получения количественных показателей метаболизма.
- Повышает достоверность прогнозов при выборе мишеней и проверке биологических гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Предлагает стандартизированные протоколы экстракции и количественного определения для воспроизводимого анализа метаболитов.
- Обеспечивает получение количественных данных, подходящих для высокопроизводительного скрининга метаболических фенотипов.
- Поддерживает масштабируемость анализа и повторное использование платформы для различных растительных систем.
- Позволяет надежно оценивать влияние соединений или генетических вмешательств на метаболизм нуклеотидов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет метаболическое профилирование с поиском биомаркеров, значимых для заболевания или признака, в моделях растений.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации метаболических вмешательств.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем количественной оценки модуляции путей.
- Повышает эффективность прогнозного снижения рисков для трансляционных исследований в системах производства на основе растений.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод ВЭЖХ-МС/МС интегрируется в рабочие процессы исследований и разработок на растительном сырье, начиная с этапа первичного поиска и заканчивая идентификацией ведущих соединений и доклинической валидацией.
- Биология открытий: позволяет проводить тестирование функций метаболических путей и взаимодействия с мишенями на основе выдвинутых гипотез.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные измерения метаболитов для разработки анализов и проведения скрининговых кампаний.
- Аналитика: предоставляет надежные калибровочные кривые и статистические данные для достоверного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: поддерживает согласованность биомаркеров и преемственность между этапами открытий и доклиническими фазами.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированную масштабируемую платформу, применимую к нескольким видам растений и вариантам дизайна экспериментов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов и снижает неопределенность механизмов при изучении метаболических путей.
- Операционная ценность: Стандартизирует подготовку проб и количественное определение для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки, а также эффективно управлять инвестиционным портфелем.
- Влияние на портфель: Способствует приоритезации с учетом рисков и развитию программ НИОКР в области растениеводства.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с образцами растений и опыт эксплуатации систем ЖХ-МС/МС.
- Необходим доступ к высококачественной инфраструктуре для масс-спектрометрии и хроматографии.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов экстракции и калибровки.
- Метод применим к различным видам растений и потенциально к другим биологическим матрицам.
- Пропускная способность подходит для исследований среднего масштаба (10–20 образцов за двухдневный цикл).
