Выделение высококачественных предсердных и желудочковых миоцитов мышей для одновременного измерения переходных процессов Ca2+ и кальциевого тока L-типа

Эксперименты с зажимом пластыря и визуализацией кальция являются трудоемкими, трудоемкими и сложными. Этот протокол обеспечивает удобный метод выделения высококачественных кардиомиоцитов предсердий и желудочков мышей, подходит для экспериментов с наложением пластыря и одновременной визуализации кальция. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что мы можем получить предсердные и желудочковые кардиомиоциты от одного и того же животного.

Выделение кардиомиоцитов предсердий мышей является особенно сложной задачей и является ограничивающим фактором для предыдущих экспериментов. Начните с предварительного заполнения аппарата Лангендорфа перфузионным буфером и убедитесь, что в нем нет воздуха. Зафиксируйте аортальную канюлю под микроскопом для рассечения и соедините ее с помощью одномиллилитрового шприца, наполненного перфузионным буфером.

После извлечения сердца из усыпленной мыши поместите сердце в перфузионный буфер комнатной температуры и как можно быстрее канюлируйте аорту тупым концом иглы под микроскопом. Крепко привяжите сердце к игле куском сшивающего шелка, и отсоедините шприц. После канюляции аорты немедленно подключите канюлированное сердце к аппарату Лангендорфа, избегая попадания воздуха в систему.

Перфузируйте сердце перфузионным буфером в течение одной минуты при температуре ровно 37 градусов Цельсия и скорости перфузии четыре миллилитра в минуту. Переключитесь с перфузии на буфер для пищеварения и перфузируйте ровно на девять минут при температуре 37 градусов Цельсия и скорости перфузии четыре миллилитра в минуту. Когда закончите, переложите переваренное сердце в чашку Петри с достаточным буфером для пищеварения, чтобы оно было полностью покрыто.

Затем тщательно рассекают предсердия и желудочки под микроскопом. Перенесите предсердия в чашку Петри с 1,5 миллилитрами буфера для пищеварения, а желудочки — в другую чашку Петри с тремя миллилитрами буфера для пищеварения. Аккуратно, но быстро раздвиньте предсердия на мелкие кусочки с помощью тупых щипцов.

Растворите ткань, осторожно пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника пипетки объемом 1000 микролитров, который был предварительно обрезан для расширения отверстия наконечника. Перелейте раствор в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте эквивалентное количество стоп-буфера, пипетируя вниз по боковой стороне пробирки. Пропустите все три миллилитра раствора через нейлоновую сетку толщиной 200 микрометров, чтобы удалить оставшиеся более крупные кусочки ткани, которые не были полностью переварены.

Чтобы выполнить диссекцию желудочков, разрежьте ткань желудочка на мелкие кусочки с помощью ножниц для рассечения или щипцов и пипетируйте вверх и вниз еще одним наконечником пипетки объемом 1000 микролитров, чтобы раствориться. Перелейте клеточный и тканевый раствор в 15-миллилитровую центрифужную пробирку и добавьте эквивалентное количество стоп-буфера, осторожно проведя его пипетированием по боковой стороне пробирки, чтобы завершить реакцию. Пропустите все шесть миллилитров клеточного и тканевого раствора через нейлоновую сетку толщиной 200 микрометров, чтобы удалить более крупные части, которые не были полностью переварены.

Оставьте суспензию предсердных и желудочковых клеток на скамье при комнатной температуре на шесть минут, чтобы они остыли. Затем центрифугируйте пробирки при 5G в течение двух минут. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пластиковой пастеровской пипетки и осторожно ресуспендируйте клеточные гранулы в 10 миллилитрах раствора Tyrode's, не содержащего кальция.

Оставьте клетки предсердий и желудочков на восемь минут для оседания. Центрифугируйте клетки предсердий в режиме 5G в течение одной минуты. Затем отбросьте надосадочную жидкость из обоих образцов клеток и осторожно повторно суспендируйте гранулы в 10 миллилитрах раствора Тайроде со 100 микромолярами кальция.

Оставьте клетки на восемь минут для отстаивания, затем повторите центрифугирование клеток предсердий. Откажитесь от надосадочной жидкости и осторожно ресуспендируйте клеточные гранулы в 10 миллилитрах раствора Тироде с 400 микромолярами кальция. Повторите этот процесс еще раз, суспендируя клетки в растворе Тироде с одним миллимолярным кальцием.

Все клетки предсердий имеют небольшие размеры и емкость составляет примерно от 35 до 100 пикофарадов. Здесь показана типичная клетка из работающего миокарда предсердий. Желудочковые миоциты имеют более палочковидную форму и крупные, с емкостью клеток от 100 до примерно 400 пикофрад.

Здесь приведены примеры измерений кальциевого тока L-типа с одновременными цитозольными кальциевыми переходными процессами из одного миоцита предсердий и одного миоцита желудочков. Прежде чем попробовать эту технику, обязательно попрактикуйтесь в извлечении органов. Очень важно, чтобы этот шаг был выполнен быстро и все разрезы тканей были сделаны в правильных местах.

Когда забор органов выполняется с воспроизводимым качеством, уделите некоторое время для идеального канюляции. Клетки, выделенные с помощью этого протокола, подходят для измерений с помощью патч-клэмпа. Кроме того, они могут быть загружены флуоресцентными красителями, что позволяет проводить широкий спектр экспериментов с визуализацией.