Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

Здравствуйте, и добро пожаловать в лабораторию архитектуры и реактивности РНК в Институте молекулярной и клеточной биологии в Страсбурге. Выращивание хорошо обезврошаемых кристаллов является важным шагом в любом кристаллографическом исследовании. В этом видео мы продемонстрируем использование нового микрофлюидного инструмента для выращивания кристаллов биомолекулы и определения ее 3D-структуры с помощью рентгеновской дифракции на месте.

Микрофлюидное устройство под названием ChipX представляет ряд преимуществ. Он предназначен для миниатюризации и облегчения кристаллизации активов методом противодействия диффузии. Его настройка проста и выполняется со стандартным лабораторным материалом.

Он также оптимизирован для прямой характеристики кристаллов, выращенных в чипе, с помощью серийной рентгеновской кристаллографии. ChipX устраняет кристаллические обработки и крио-охлаждения шаги и сохраняет внутреннее качество кристаллов, которые анализируются на месте и при комнатной температуре. ChipX имеет формат слайда микроскопа, 7,5 на 2,5 сантиметра.

Он содержит восемь микрофлюидных каналов, используемых в качестве камер кристаллизации с разделом 80 на 18 микрометров и длиной четыре сантиметра. Вход на левой стороне позволяет вручную впрыскить раствор биомолекулы, который будет заполнять восемь каналов до резервуаров. Решения кристаллизации откладываются в этих резервуарах на правой стороне.

Кристаллизация вызвана явлением, называемым контр-диффузией. Когда кристаллизующий агент рассеивается в раствор биомолекулы и создает концентрацию и супер градиент насыщения. Этикетки и bost вдоль каналов помочь найти кристаллы легче.

Настройка чипа требует от пяти до шести микролитров раствора биомолекулы при типичной концентрации от пяти до 10 миллиграммов на миллилитр. Одно микролитровое парафиновое масло, пять микролитров раствора кристаллизации на резервуар и клейкой лентой. Загрузка ChipX осуществляется вручную с помощью микропипетта и стандартных наконечников.

Синий образец решения используется в этом примере для лучшей визуализации процесса инъекций. Чтобы избежать утечки, наконечник вставляется в образец вход перпендикулярно чип. Один микролитер парафинового масла загружается после образца, чтобы отделить каналы друг от друга.

Затем вход в образец запечатывается лентой. Восемь резервуаров загружаются индивидуально пятью микролитров кристаллизирующегося раствора агента. Для этого наконечник пипетки помещается близко к концу канала под углом около 45 градусов.

Это предотвращает образование воздушного пузыря между образцом и кристаллизирующимся агентом. Резервуары могут быть заполнены коктейлями, содержащими различные буферы, полимеры или соли и так далее, для скрининга или оптимизации. Водохранилища запечатаны скотчем.

Как попродемонстрировано здесь, настройка чипа проста и занимает всего несколько минут. В ChipX кристаллизация происходит путем встречного диффузии. Кристаллизирующие агенты, депонирующиеся в резервуарах, рассеиваются в каналах, содержащих биомолекулу.

Это создает градиенты концентрации и супер насыщенности, что вызовет кристаллизацию. Это примеры кристаллов фермента, полученного внутри каналов. Они могут расти, чтобы заполнить каналы, которые имеют поперечное сечение 80 на 80 микрометров.

Кристаллы легко обнаруживаются в ChipX с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием естественной флуоресценции остатков триптофана под ультрафиолетовым светом, или, как показано здесь с помощью флуоресцентно помеченного белка. В этом разделе показан телеграфный анализ Криса, проведенный в швейцарском источнике света в Филаггринс Швейцарии. Чипы можно проведать к синхротрону без какого-либо дополнительного оборудования или специального ухода.

Давайте войдите в зал швейцарского источника света. Электроны циркулируют в центральном кольце и генерируют широкий спектр электромагнитных волн, включая рентгеновские лучи, эксплуатируемые на различных лучах. Это видео было записано на X06, который является лучевой линией, посвященной макромолекулярной кристаллографии.

Протокол может меняться от одного синхротронного объекта к другому, но общий принцип остается прежним. ChipX устанавливается на 3D печатный держатель. Затем этот держатель прикрепляется к магниту стандартного гониометра.

Серийный анализ последовательно собирает данные из серии кристаллов, выращенных в чипе. Списки кристаллических позиций устанавливаются с использованием этикеток и bost вдоль каналов чипа. Исследователи перемещают чип в центр кристаллов в рентгеновском луче, символизируемом желтым окном.

Запущена быстрая процедура центрирования с использованием рентгеновского луча. Остановка луча поднимается на место, и детектор движется к образцу. Скрининг сетки выполняется для обеспечения выравнивания кристалла с лучом.

Та же процедура повторяется после вращения чипа на 30 градусов. Второй шаг важен, потому что материал чипа создает эффект параллакса, который приводит к сдвигу максимума дифракции по отношению к наблюдаемому кристаллическому положению. Как только кристалл центрируется в луче, начинается сбор данных.

Эта последовательность показывает сбор данных в режиме реального времени. Чип вращается на 30 градусов. Между тем, соответствующие изображения дифракции собираются детектором.

Характеристика этого кристалла завершена. Чип переводится на следующий кристалл в канале и вся процедура повторяется. Обратите внимание, что этот анализ работает на месте без непосредственной обработки кристалла и при комнатной температуре.

Данные, собранные по ряду кристаллов, затем объединяются для получения полного набора данных дифракции, который используется для вычисления карты плотности электронов, показанной синим цветом, и для построения атомной модели. Процедура, описанная в этом видео, была применена в рамках структурной характеристики фермента модификации тРНК. Фермент CCA-добавляя от холодной адаптированной бактерии, галококка галокрифилы.

ChipX был использован для кристаллизации фермента путем встречного диффузии в присутствии сульфида аммония в качестве кристаллизирующего агента. По-пирамидальные кристаллы появились вдоль каналов, после нескольких дней инкубации при 20 градусах по Цельсию. Флуоресцентная маркировка белка способствовала выявлению кристаллов белка и их дискриминации от кристаллов соли.

Серия кристаллов была проанализирована на месте и при комнатной температуре. Их данные дифракции были объединены и привели к кристаллической структуре фермента APOE с разрешением 2,5 ангстрема. Кроме того, диффузия окружающей среды в чиповых каналах использовалась для доставки субстрата ферменту, который создает кристаллы.

В данном случае аналог CTP был добавлен в решения резервуара за два дня до синхротронного анализа. Это позволило соединению рассеяться и достичь каталитического участка фермента. Как видно из кристаллической структуры комплекса определяется при разрешении 2,3 ангстрема.

Протокол, продемонстрированый в этом видео, как правило, применим и был протестирован на различных биомолекулах. Для заключения ChipX является инструментом чипа Lab, который интегрирует все этапы кристаллографического исследования и позволяет перейти от биомедицинского решения к кристаллической структуре в уникальном микрофлюидальном устройстве. Спасибо за просмотр этого видео.

и мы надеемся, что мы убедили вас в преимуществах использования ChipX для кристаллизации и определения кристаллической структуры ваших любимых Biomolecule.