Использование Grafix для обнаружения переходных интеракторов Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Метод градиентной фиксации, при котором градиентное центрифугирование глицерина выполняется в присутствии сшивателя, помогает выявить взаимодействия между белками, которые временно связываются с мультисубъединичными комплексами. Использование реагентов фиксации в глицериновом градиенте стабилизирует связывание рыхлых факторов без образования осадков, что позволяет идентифицировать взаимодействия специфических белков со сплайсированными полукомплексами. Демонстрация конечного протокола помогает новым пользователям усвоить информацию, которую может быть трудно понять, исходя только из письменного текста.

Для получения общего экстракта дрожжей выращивают дрожжевые клетки, экспрессирующие один из факторов сплайсинга, слитых с крановой меткой, и один литр глюкозной среды Y и B с добавлением соответствующих аминокислот или нуклеиновых оснований. Когда культура достигнет оптической плотности на уровне 600 нанометров от одного, соберите дрожжевые клетки методом центрифугирования в три центрифуги объемом 500 миллилитров и промойте клетки два раза в 10 миллилитрах холодной стерильной воды за одну промывку. После второй промывки ресуспендировать клетки в одной 10-й части объема клеток холодным буфером А, и заморозить 50 микролитров клеточной суспензии дрожжей в жидком азоте.

После замораживания измельчите гранулы замороженных клеток в течение шести циклов при 20 герц в течение трех минут в устройстве шаровой мельницы, погружая контейнер с замороженными ячейками в жидкий азот в конце каждого цикла. После последнего цикла поместите пробирки с экстрактами в воду комнатной температуры, время от времени встряхивая. После расплавления центрифугируйте для сбора экстрактов.

И количественно определить белок, который выводится надосадочная жидкость методом ВСА. Затем быстро заморозьте аликвоты экстрактов в жидком азоте для хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы получить глицериновый градиент, добавьте 0,1% концентрацию сшивающего агента глутаральдегида в 30% раствор глицерина и буфера А и перемешайте до гомогенизации.

Добавьте шесть миллилитров холодного 10% глицерина и буферного раствора А в 12-миллилитровую центрифужную пробирку и с помощью шприца градиентного мастер-устройства, оснащенного длинной иглой, наложите 30% раствор глутаральдегида на дно пробирки. Используйте мастер-устройство градиента для создания линейного градиента глицерина в соответствии со спецификациями производителя. Осторожно нанесите 200 микролитров 7% глицерина и буферизуйте подушку А в верхней части градиента, прежде чем добавить примерно два миллиграмма клеточного экстракта в верхнюю часть пробирки.

После получения градиента глицерина поместите образец в предварительно охлажденный ротор качающегося ведра и соберите экстракт путем центрифугирования. Выделите образец из каждой пробирки объемом 12 миллилитров на 24 500 микролитровых фракций и с помощью перистальтического насоса протолкните 40%-ный раствор глицерина через 10-30%-ный градиент от пробирки к сбору фракций. Затем загрузите по 50 микролитров каждой фракции непосредственно на мембраны нитроцеллюлозы на дот-блот, с последующим добавлением блокирующего буфера, и используйте первичное антитело против CBP для обнаружения белка на иммуноблоте и соответствующее вторичное антитело по мере необходимости.

При отсутствии сшивающего агента CWC 24 концентрируется между фракциями 5 и 13, что соответствует комплексам примерно от 80 до 200 мегадальтон. Однако в присутствии сшивающего агента положение CWC 24 на градиенте смещается в сторону дробей в нижней части градиента, соответствующих более крупным комплексам. Сравнение седиментации CWC 24 с субъединицей U5 snRNP, Prp8, и субъединицей NTC, Prp19, показывает, что концентрация CWC 24 в одних и тех же фракциях.

Но, поскольку он временно связывается со сплайсосомой, он также присутствует в более легких фракциях. Интересно, что фракции 11 и 12 — это те, в которых Prp8 и 19 начинают концентрироваться, что позволяет предположить, что это часть градиента, где комплекс В-акта начинает осаждаться. Вестерн-блоттинг фракций 11 и 12 показывает, что сигналы Prp8 и 19 являются мазками, которые едва проникают в 8%-ный акриламидный гель, показывая, что они действительно являются частью больших комплексов.

CWC 24 также присутствует во фракции 12, но в гораздо более низкой концентрации, что согласуется с его переходным связыванием с комплексом B Act. В совокупности эти результаты показывают, что глутаральдегид может быть использован в качестве сшивающего агента для стабилизации связывания переходных факторов со сплайсинговыми субкомплексами. Этот метод может быть применен для исследования любых динамических моторных субъединичных комплексов, которые временно связываются с некоторыми их компонентами, такими как сплайсосома.