Пошаговый посев клеток на тесселлированных каркасах для изучения прорастающего кровеносного сосуда

Наш протокол позволяет исследователям изучать процесс формирования сети сосудов четким и легко отслеживаемым образом, открывая двери для новых исследований и проливая свет на поведение кровеносных сосудов. Данная методика представляет возможность создания высокоорганизованных и воспроизводимых сосудистых сетей с ответом на окружающую среду. Эндотелиальные клетки у пациентов, страдающих сосудистым заболеванием, могут быть извлечены с помощью этой системы, что позволяет воссоздать сосудистое заболевание и найти соответствующее лечение.

Предложенный способ может быть расширен для изучения поведения сосудистой сети в паре с различными типами клеток, что позволяет наблюдать взаимодействие развивающихся сосудов с определенным типом ткани. Начните с погружения каркасов в 70% этанол в течение минимум 15 минут, затем дважды промыть их в PBS. Смешайте 1,5 микролитра раствора фибронектина с 28,5 микролитрами PBS на каркас для посева.

Подготовьте одно разведение фибронектина, которое будет использоваться для всех каркасов, чтобы избежать ошибок пипетирования. Поместите каркасы редко на поверхность гидрофобии и покройте каждый каркас 30 микролитами разведения фибронектина. Замените крышку пластины и поместите покрытые фибронектином каркасы в инкубатор, установленный на 37 градусов цельсия и 100% влажность в течение как минимум одного часа.

После инкубации слегка промойте каркасы в PBS, чтобы удалить остатки фибронектина. Строительные леса могут храниться в PBS при четырех градусах Цельсия в течение недели. Готовят эндотелиальную клеточную или EC-среду путем смешивания базальной среды с соответствующими компонентами набора среды, включая раствор антибиотика, FBS и добавки для роста эндотелиальных клеток, как указано производителем.

Производят микрососудистую эндотелиальную клеточную суспензию жиров человека в ЕС-среде с концентрацией четыре миллиона клеток на миллилитр. Используя щипцы, поместите один каркас с фибронектиновым покрытием на скважину в пластину без TC 24-скважины. Накройте каждый каркас 25 микролитровыми каплями клеточной суспензии, следя за тем, чтобы суспензия не стекала от каркаса.

Положите крышку на тарелку и поместите ее в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 100% влажности в течение 60-90 минут. После инкубации заполните каждую лунку 700 микролитрами среды ЕС. Инкубируют эндотелиализованные каркасы до тех пор, пока слияние ЭК не будет наблюдаться с помощью флуоресцентной микроскопии или в течение трех дней.

Меняйте среду через день. Готовят среду DPSC путем смешивания 500 миллилитров низкоглюкогодичных DMEM, 57,5 миллилитра FBS, 5,75 миллилитра незаменимых аминокислот, 5,75 миллилитра GlutaMAX и 5,75 миллилитра раствора пенициллин-стрептомицин-нистатин. Перенесите эндотелиализованные леса в новую 24-скважинную плиту, не вносяную ТС.

Отбросьте все среды с текущей пластины с помощью пипетки или вакуумного всасывания, позаботясь о том, чтобы не применять вакуум непосредственно к каркасу. Поместите один каркас в центр каждого колодца, затем высушите окружающую область легким вакуумом. Разбавляют растворы тромбина и фибриногена ПБС до конечной концентрации пять единиц на миллилитр и 15 миллиграмм на миллилитр соответственно.

Подготовьте восемь миллионов DPSC на миллилитр суспензии в разбавлении тромбина и распределите 12,5 микролитра суспензии по отдельным микротрубкам на каркас для посева. Установите пипетку от пяти до 50 микролитров до 12,5 микролитров и заполните ее раствором фибриногена. Не снимая наконечника, установите пипетку на 25 микролитров.

Материал в наконечнике должен подняться и оставить пустой объем. Медленно нажимайте кнопку плунжера до тех пор, пока жидкость не достигнет отверстия наконечника, но не вытечет наружу. Удерживайте плунжер в этом положении и поместите наконечник в одну из микроцентрифужных трубок, содержащих клетки в тромбиновой суспензии, убедившись, что наконечник находится в контакте с жидкостью.

Осторожно отпустите кнопку плунжера и втяните суспензию ячейки в наконечник. Тщательно перемешайте оба материала, избегая образования пузырьков. Быстро распределяйте смешанные материалы поверх эндотелиализованного каркаса.

Повторите предыдущие шаги для каждого каркаса, обязательно меняя наконечники между применениями, чтобы избежать неожиданного образования фибринового геля внутри наконечника. Замените крышку пластины и высиживайте каркасы при температуре 37 градусов по Цельсию, 5% углекислого газа и 100% влажности в течение 30 минут. После инкубации заполните каждую лунку одним миллилитром среды DPSC и EC.

Культура в течение одной недели, меняя среду через день. В разные моменты времени во время культивирования извлекайте среду из колодца и визуализруйте конструкции с помощью конфокального микроскопа для изучения развития сосудов или любого другого интересующих параметра. Этот протокол позволяет изготавливать тесселированные строительные леса из фоторезиста СУ-8.

Получены строительные леса с четкой геометрией отсека и высокоточными и воспроизводимыми характеристиками. При традиционном одновременном посеве как эндотелиальных клеток, так и опорных клеток клетки были гомогенно распределены по каркасу, что привело к непредсказуемым и дезорганизованным сосудистым сетям. Напротив, ступенчатое посев клеток привело к высокоорганизованным сосудистым сетям.

При использовании флуоресцентных эндотелиальных клеток сосуды могут быть визуализированы в режиме реального времени. Красные флуоресцентные белки, экспрессивающие эндотелиальные клетки, культивировали на гексагональных каркасах и визуалировали. Поддерживающие клетки были добавлены в первый день, а сосудистые сети были визуализированы через день для количественной оценки развития сосудов.

Для каждой точки времени были сделаны широкие снимки всего каркаса. Рост судна был количественно определен как общая длина и площадь судна. Была выполнена конфокальная визуализация замедленной съемки, позволяющая отслеживать один сосуд с использованием разноцветных эндотелиальных клеток.

Траектория судна была сформирована из замедленной съемки, что позволило наблюдать миграцию судна. Созревание сосудов наблюдалось по наличию гладкомышеского актина и поддерживающих клеток. Для круговых, шестиугольных и квадратных отсеков клетки размножаются и организуются в структуры.

К седьмому дню все формы показали богатую и сложную сосудистую сеть. Изображения с более высоким увеличением показали более плотный актин гладких мышц и присутствие поддерживающих клеток, совместно локализованных с сформированными сосудами, что свидетельствует о рекрутировании и дифференцировки клеток поддержки, окружающих сосудистые структуры. Этот метод может быть использован для изучения поведения трехмерных сосудистых сетей при воздействии различных условий, таких как специфические ингибиторы клеток или в присутствии дополнительных типов клеток.