Применение мыши Партеногенетические гаплоидные эмбриональные стволовые клетки в качестве замены спермы

Этот протокол ложно датирует модификацию геномного импринтинга в эмбриональных стволовых клетках гаплоидной мыши, как у нашего субъекта, из-за ложных сперматозоидов, что позволяет генерировать доморощенные эмбрионы у мышей. Генетическая модификация гаметы, как правило, требует сложных методов. Используя эту методологию, родительские гаметы могут быть манипулированы в гибридных эмбриональных стволовых клетках для последующего введения мышам в качестве варианта замещения сперматозоидов.

Поскольку этот метод позволяет искусственно модифицировать отцовскую гамету у эмбрионов, он особенно применим для изучения геномного импринтинга и прижигания. Демонстрировать эту процедуру будет Шарль Этьен Дюмо, мышиный эмбриолог из моей лаборатории. Чтобы подготовить к эксперименту пипетки для удержания и микроинъекции, сначала с помощью съемника микропипеток вытягивайте капилляры из боросиликатного стекла с вытянутой формой и постепенным сужением.

Чтобы приготовить пипетки для удержания, поместите вытянутый капилляр с наружным диаметром от 60 до 100 микрометров в микроковке над стеклянным шариком на нити. Включите нить и опустите капилляр до тех пор, пока он не соприкоснется с бусиной. Когда капилляр прикрепится к бусине, выключите нить и втяните капилляр, в результате чего капилляр сломается прямым концом.

Затем расположите сломанный кончик капилляра горизонтально рядом со стеклянной бусиной на нити и нагрейте нить, чтобы расплавить конец, пока внутренний диаметр кончика капилляра не достигнет от 10 до 20 микрометров в диаметре. Затем расположите капилляр над стеклянным шариком примерно в одном миллиметре от кончика и нагрейте нить, чтобы капилляр согнулся под углом 20 градусов. Чтобы приготовить пипетку для микроинъекций, поместите вытянутый капилляр с внешним диаметром около шести микрометров над стеклянной бусиной на нагретой нити и опустите капилляр до тех пор, пока он не соприкоснется с шариком.

Как только капилляр прикрепится, выключите нить и втяните капилляр. Капилляр разорвется прямым концом. Затем переместите капилляр по стеклянной бусине примерно в одном миллиметре от кончика капилляра и нагрейте нить, чтобы капилляр согнулся под углом 20 градусов.

Чтобы выполнить интрацитоплазматическую инъекцию, поместите пять микролитров раствора ПВП и 20 микролитров капель среды М2 на перевернутую крышку 10-сантиметровой посуды и залейте капли минеральным маслом. Поставьте чашку на сцену и установите на микроманипулятор удерживающую пипетку. С помощью наконечника микрозагрузчика заполните пипетку для микровпрыска фторуглеродным маслом и установите пипетку на пьезопривод

Наблюдая в микроскоп, опустите пипетку для микроинъекций в каплю раствора ПВП. Когда пипетка погружена, проведите пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы покрыть стекло PVP. Загрузите небольшой объем раствора ПВП в пипетку для микроинъекций.

Погрузите пипетки для микроинъекций и удержания в среду M2 и сосредоточьтесь на пипетке в нижней части капли. Перенесите примерно два микролитра суспензии партогенных ES-клеток с двойным нокаутом в каплю среды M2 и с помощью ротовой пипетки перенесите 10 ооцитов M2 в ту же каплю. Поверните одну ооцит и надавите отрицательным давлением через удерживающую пипетку, чтобы удерживать ооцит так, чтобы пространство перивителлина было обращено к пипетке для микроинъекций, следя за тем, чтобы пластина со второй метафазой не располагалась на пути пипетки для микроинъекций.

Втяните одну двойную нокаутную партогенную ES-клетку в кончик пипетки для микроинъекций и подтвердите разрыв клеточной мембраны. Подайте легкое отрицательное давление на пипетку для микроинъекций и подайте четыре пьезоимпульса, проталкивая кончик пипетки для микроинъекций к перивителлиновому пространству, чтобы прорваться через пеллюцидную зону. Проникните в ооцит с помощью микроинъекционной пипетки так, чтобы оолемма вытянулась в противоположную сторону, и подайте один пьезоимпульс для прокалывания оолеммы, убедившись, что оолемма ее расслабляется по ходу ствола микроинъекционной пипетки.

Введите в ооплазму партогенную ЭС-клетку с двойным нокаутом с минимальным объемом среды и плавно выведите микроинъекционную пипетку из ооцита. Выпустите введенный ооцит из удерживающей пипетки и переместите его в сторону микрокапли для последующего сбора. После того, как все ооциты будут введены, перенесите ооциты в предварительно подогретую центральную лунку, содержащую среду KSOM, и инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение одного часа до активации.

Анализ содержания ДНК этой репрезентативной партогенной линии клеток ES с двойным нокаутом, несущей трансген CAG/EGFP методом проточной цитометрии, иллюстрирует распределение гаплоидных и диплоидных клеток в фазах G0, G1, S и G2 M. Генотипирование может быть выполнено для подтверждения отсутствия аллелей дикого типа в H19 и межгенных дифференциально метилированных областях. Трансген CAG/EGFP может быть введен в патогенные ES-клетки с двойным нокаутом для изучения их вклада в полуклонированные эмбрионы путем визуализации зеленой флуоресценции под микроскопом.

Анализ проточной цитометрии показывает две популяции, соответствующие фазе G2 M: остановленные гаплоидные и диплоидные клетки после лечения демукульценом. Отсутствие 1N гаплоидного пика указывает на то, что цикл покоя клетки был в значительной степени завершен. После инъекции экспрессия EGFP редко обнаруживается в сконструированных полуклонированных эмбрионах.

по мере того, как цитоплазма партогенных ES-клеток с двойным нокаутом диспергируется в большой цитоплазме ооцита. Через шесть часов после активации под микроскопом можно наблюдать до трех полярных тел. Первое и второе полярные тельца ооцита и одно псевдополярное тельце из гаплоида ЭСК.

Чтобы продемонстрировать свою компетентность в развитии, полуклонированные эмбрионы могут быть культивированы до стадии бластоцитов. Кроме того, доношенные самки мышей могут быть получены из полуклонированных эмбрионов двух клеточных стадий, перенесенных в яйцеводы самок-реципиентов. Во время микроинъекции важно разорвать плазматическую мембрану гаплоидных эмбриональных стволовых клеток, чтобы предотвратить сегрегацию хромосом при активации ооцита.

Вместо партеногенетических гаплоидных ES-клеток также могут быть использованы андрогенные гаплоидные ES-клетки, что позволяет выбрать либо материнскую, либо отцовскую гамету в качестве замены сперматозоидов в зависимости от цели исследования.