CRISPR/Cas9 Редактирование гена C. elegans rbm-3.2 с использованием скринингового маркера dpy-10 Co-CRISPR и собранных рибонуклеопротеиновых комплексов.

Этот метод полезен для введения точных мутаций в C.elegans путем редактирования генома CRISPR/Cas9 в течение короткого периода времени. Этот метод обеспечивает эффективный, оптимизированный способ редактирования генома C.elegans, поскольку использование маркера Co-CRISPR значительно повышает вероятность идентификации положительно отредактированных червей. Обязательно потренируйтесь в выполнении микроинъекций и вводите оба звена гонад как можно большему количеству червей, чтобы увеличить шансы на получение желаемых изменений.

Демонстрировать процедуру будут Эми Смит, Мэри Бергвелл, Данита Мэтью, Элли Смит и Картер Дирлам, которые являются студентами бакалавриата из моей лаборатории. Чтобы подготовить молодых взрослых червей к инъекции, соберите L2, L3 стадии C.elegans на свежей бактериальной лужайке на планшете MYOB и инкубируйте планшет при температуре 20 градусов Цельсия в течение ночи. На следующее утро приготовьте смесь для инъекций, как указано в таблице, в стерильных пробирках без нуклеазы и перемешайте с помощью пипетирования.

Инкубируйте смесь для инъекций при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы собрать рибонуклеопротеиновые комплексы, прежде чем вращать смесь путем центрифугирования. Затем с помощью препарирующего микроскопа выберите около 30 молодых взрослых червей с менее чем 10 эмбрионами в матке, и введите обе гонады каждого червя по несколько пиколитров инъекционной смеси на каждую руку. После микроинъекции с помощью восстановительного аппарата осторожно введите введенных пипеткой червей из инъекционной подушечки на 60-миллиметровую пластину MYOB, засеянную OP50 E.coli.

Дайте введенным червям восстановиться в течение одного часа при комнатной температуре. В конце периода восстановления используйте кирку из платиновой проволоки, чтобы перенести каждого введенного червя на одну засеянную 35-миллиметровую агаровую пластину MYOB и дайте червям отложить яйца при температуре 20 градусов Цельсия. Через 24 часа переложите введенных червей на новые индивидуальные 35-миллиметровые пластины.

В течение трех-четырех дней после инъекции используйте препарирующий микроскоп для идентификации планшетов, в которых потомство F1 демонстрирует роликовые фенотипы, на что указывает вращение тела животного вокруг своей длинной оси, когда животные движутся по кругу, и глупые фенотипы, о чем свидетельствует более короткая и толстая физиология по сравнению с контрольными животными на той же стадии развития. Пересадите от 50 до 100 сизоворонок F1 в их отдельные тарелки и дайте червям отложить яйца в течение одного-двух дней. После одного-двух дней производства червей F2 перенесите каждую отдельную мать валиков F1 с пронумерованной пластины в соответствующую пронумерованную ПЦР-пробирку, содержащую 2,5 микролитра буфера для лизиса, дополненную разведением 1:100 20 мг на миллилитр протеиназы K. Заморозьте пробирки при температуре минус 30 градусов Цельсия на 20 минут перед лизисом червей в термоциклере. как указано.

В конце цикла добавьте 12,5 микролитров смеси 2X PCR, содержащей дезоксинуклеозидтрифосфаты, ДНК-полимеразу, хлорид магния и загрузочный краситель, один микролитр 10 микромольного прямого праймера, один микролитр 10 микромольного обратного праймера и достаточное количество стерильной воды, чтобы довести реакционную смесь до 25 микролитров на каждый образец лизированного червя. Затем запустите образцы на амплификаторе, как указано. Для скрининга изменений длиной менее 50 пар оснований перенесите по 10 микролитров каждой ПЦР-реакции в новую пробирку и добавьте пять микролитров мастер-смеси для рестрикционного разложения в каждую пробирку.

Инкубируйте реакции пищеварения при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. В конце инкубации нагрейте и активируйте пищеварительные процессы с помощью 10-15-минутной инкубации при температуре 65 градусов Цельсия. Затем загрузите всю реакцию из каждой пробирки в одну лунку с 1%-2%-ным агарозным гелем и запустите гель при давлении 110 миллиампер до тех пор, пока не будет достигнуто правильное разделение полос.

В конце прогона визуализируйте агарозные гели под воздействием ультрафиолетового излучения, чтобы определить размеры полос ДНК. Положительно отредактированные черви будут отображать дополнительную полосу ДНК в ожидаемом размере из-за редактирования с использованием шаблона репарации, перенося сайт рестрикции в желаемый локус в геноме червя. Выберите от 8 до 12 диких червей F2 из соответствующих положительно отредактированных пластин роликовых червей F1 и дайте червям отложить яйца и произвести потомство в течение одного-двух дней.

Затем определите гомозиготные линии червей, как показано для положительно отредактированных червей, и проанализируйте результаты секвенирования с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей для подтверждения наличия редактирования в соответствии со стандартными протоколами. Здесь можно наблюдать геномную ДНК и спроектированную CRISPR РНК и матрицу репарации для гена C.elegans rbm-3.2. В этом репрезентативном анализе семь из 73 червей F1 оказались положительными для редактирования.

Неотредактированные черви демонстрировали один фрагмент ДНК из 445 пар оснований при переваривании EcoRI, в то время как черви, несущие преждевременный стоп-кодон в гене rbm-3.2, демонстрировали два фрагмента на 265 и 166 парах оснований при расщеплении EcoRI. Гетерозиготные отредактированные черви демонстрировали три фрагмента при переваривании EcoRI. Шесть из 12 червей F2 из идентифицированных положительных гетерозигот F1 были признаны гомозиготными для интересующей их редакции.

Геномная ДНК идентифицированной гомозиготной отредактированной линии червей может быть затем использована для организации реакции секвенирования ДНК, которая подтвердит присутствие редитированной формы в ее гомозиготном состоянии. Позаботьтесь о том, чтобы реагенты для редактирования и просеивающие праймеры были спроектированы правильно, а инъекционная смесь была приготовлена должным образом. Точный микровпрыск также имеет решающее значение.

После этой процедуры может быть проведена фенотипическая валидация редактирования, если это применимо, и анализ экспрессии генов и белков для проверки точности редактирования генома.