Микрофлюидная модель для имитации первоначального события неоваскуляризации
10 апреля 2021 г.
Здесь мы предоставляем микрофлюидный чип и автоматически контролируемую, высокоэффективную микрофлюидную систему циркуляции, которая рекапиталитирует начальную микроокноронизацию неоваскуляризации, позволяя эндотелиальным клеткам (ЭК) стимулироваться высоким люминесцентным стрессом, физиологическим уровнем трансендотелиального потока и различным сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) одновременно.
Неоваскуляризация, генерация новых кровеносных сосудов является строго регулируемым процессом как в нормальных, так и в патологических явлениях. Чтобы лучше понять неоваскуляризацию, важно реконструировать процесс в естественной клеточной микросреду in vitro. Мы разработали микрофлюидный чип и автоматическое управление.
Высокоэффективные циркуляции делается для формирования перфузии микротрубок и имитации использования белка, чтобы повторить к первоначальному событию новой васкуляризации. Микрофлюидный прорастающий чип состоял из трех каналов. Эндотелиальный канал культуры клеток и жидкий канал были разделены широким центральным гидрогелевым каналом.
Система микрофлюидного управления состояла из микрохирургического насоса и электромагнитного клапана щепотки. Чип ловушки пузыря, микрофлюидный прорастающий чип, микроперистальный насос и культурный средний резервуар. С микрофлюидной системой эндотелиальные клетки могут стимулироваться высоким светимым стрессом стрижки, физиологическим уровнем трансендотелиального потока и различными сосудистыми эндотелиальными распределениями факторов роста одновременно.
Pipette 20 микролитр 125 микрограмм на миллилитр фибронектина в одном медиа-инъекционный порт канала клеточной культуры. Вырезать наконечник пипетки, чтобы соответствовать порту канала культуры клеток с ножницами. Вставьте наконечник пипетки в другой медиа-порт инъекций канала культуры клеток.
Затем, пипетка из воздуха из канала клеточной культуры, чтобы заполнить его фибронектином. Инкубировать чипсы при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа. Перед посевом клеток, пипетка 20 микролитер эндотелиальной среды ячейки в каждом порту впрыска средств массовой информации и инкубировать чипы при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
Затем, pipette из всех средств массовой информации во всех портах впрыска средств массовой информации. Далее, пипетка пять микролитеров ячейки подвески в одном медиа-инъекционный порт канала культуры клеток. Затем эндотелиальные клетки быстро распространяются по всему каналу под дифференциальным гидростатическим давлением.
Добавьте от четырех до шести микролитров ECM-средств массовой информации в другой порт, чтобы отрегулировать гидростатическое давление и остановить перемещение клеток. Дистанционное чипы в клеточный инкубатор. Затем переворачивать чипы каждые 30 минут, пока эндотелиальные клетки не покрыть внутреннюю поверхность канала культуры клеток, два часа спустя.
Используйте наконечник пипетки, чтобы удалить прикрепленные ячейки в инъекционных портах очень тщательно. Затем вставьте четыре колючие женские адаптеры Luer в порты впрыска мультимедиа и заполните ecM-медиа. Удалите чипы в клеточный инкубатор, меняй экМ-медиа и адаптеры Luer каждые 12 часов.
Для сборки микрофлюидной системы управления подготовьем две полиэтиленовые трубки, две короткие силиконовые трубки, три длинные силиконовые трубки, одну колючую женскую адаптер Luer, один разъем типа Y, а затем три разъема типа L. Заполните шприц 10 миллилитров разогретой среды ECM. Подключите полиэтиленовую трубку к шприцу с помощью колючего женского адаптера Luer.
Затем соедините другой конец полиэтиленовой трубки с разъемом типа Y. Затем соедините две длинные силиконовые трубки с двумя другими концами разъема типа Y. Мы используем одну трубку для подключения к резервуару, а другая трубка для подключения к чипу ловушки пузыря.
Подключите другую длинную силиконовую трубку к резервуару. Далее используйте две короткие силиконовые трубки для подключения всех входных и выходных отверстий на верхнем слое чипа ловушки пузыря. Подключите полиэтиленовую трубку к бэкэнду чипа.
Затем зафиксировать шприц на микрохирург насоса. Зарезать две длинные силиконовые трубки в электромагнитный клапан щепотку. Затем переключитесь электромагнитный клапан щепотки, чтобы открыть трубопровод между шприцем и резервуаром.
Ввимите средства массовой информации в резервуар с помощью микрохирургного насоса для исчерпания воздуха в трубке. Затем снова переключитесь на клапан, чтобы открыть трубопровод между шприцем и чипом ловушки пузыря. Введать средства массовой информации для заполнения жидкой камеры и бэкэнд трубки чипа ловушки пузыря.
Вынюхив эндотелиальные прорастания чипов из клеточного инкубатора, а затем удалите адаптеры Luer со стороны клеточной культуры. Вставьте две трубы пробки в гидрогель инъекционных портов микрофлюидных прорастания чипа. Подключите бэк-энд трубку чипа ловушки пузыря к одному порту канала культуры клеток.
Вставьте разъем типа T в другой порт и соедините его с длинной кремниевой трубкой, подключенной к резервуару. Затмите длинную силиконовую трубку в микро перистальтический насос. Затем вставьте воздушный фильтр в резервуар.
Затем соберите микрофлюидный прорастающий чип в верхний инкубатор сцены. Затем подключите вакуумный насос к отверстиям в нижнем слое чипа пузырчатой ловушки с помощью трубки TPU. Установите противоположный объем циркуляции и скорость потока в пользовательской программе, которая контролирует микрохирургии насоса и электромагнитного клапана щепотку одновременно.
Далее, настроить скорость потока микро перистрального насоса. Включите микрохирург насос. Затем устанавливается система контроля циркуляции.
Мы тестируем барьерную функцию некоторых микро-сосудов в нашей модели, измеряя диффузный коэффициент проницаемости 40 kDa F-I-T-C dextrin. Как показано на рисунке, коэффициент диффузной проницаемости чипа статической культуры с клеточной подкладкой составляет 0,1 плюс-минус 0,3 микрометра в секунду. А коэффициент диффузной проницаемости пустого канала без подкладки ячейки составляет 5,4 плюс-минус 0,7 микрометра в секунду.
Эндотелиальный прорастания анализ показал, что эндотелиальные клетки проросли в центральный гидрогель в основном после 24 часов статического культивирования, в то время как степень прорастания значительно снизилась с увеличением светимого стресса стрижки. Количественно, светящийся стресс стрижки значительно уменьшился эндотелиального прорастания с точки зрения площади прорастания, средняя длина прорастания, и самая длинная длина ростка. С нашей системой, стрижка нагрузки на эндотелиальные клетки могут быть дополнительно изменены в любое время во время эксперимента в то время как трансендотелиальный поток остался на физиологическом уровне.
Эта биомиметическая модель in vitro 3D может быть непосредственно применена к изучению механизма неовасуляризации и имеет потенциальную перспективу в качестве недорогой платформы для скрининга лекарств и применения токсикологии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлено описание разработки микрофлюидной 3D-модели in vitro, которая воспроизводит начальные этапы неоваскуляризации в физиологических условиях. Модель, получившая название MIEN, объединяет в себе микрофлюидный чип для стимуляции прорастания сосудов и автоматизированную систему циркуляции для имитации биомеханической и биохимической микросреды эндотелиальных клеток (ECs) на ранних стадиях неоваскуляризации. Эта платформа позволяет осуществлять точный контроль напряжения сдвига в просвете, трансэндотелиального потока и градиентов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), что делает ее ценным инструментом для изучения механизмов развития сосудов и скрининга лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология сосудов
- Тканевая инженерия
- Микрофлюидика
Теоретическое введение
- Неоваскуляризация представляет собой процесс образования новых кровеносных сосудов из существующих, что имеет решающее значение как в физиологическом, так и в патологическом контекстах.
- Начальное микроокружение, в котором находятся эндотелиальные клетки (ECs) в процессе неоваскуляризации, значительно отличается от условий на более поздних стадиях.
- Существующие модели часто не позволяют точно имитировать ранние биомеханические и биохимические условия неоваскуляризации.
- Существует потребность в системах in vitro, которые воспроизводят эти начальные события для проведения механистических и трансляционных исследований.
Цель исследования
- Разработать трехмерную модель in vitro, имитирующую начальный процесс неоваскуляризации в физиологических условиях микроокружения.
- Обеспечить возможность контролируемого воздействия напряжения сдвига, трансэндотелиального потока и градиентов VEGF на эндотелиальные клетки.
- Создать платформу, подходящую для изучения механизмов процессов, а также для скрининга лекарственных препаратов и токсикологических исследований.
Используемые методы
- Изготовление микрофлюидного чипа для изучения спрутинга с тремя каналами: каналом для культивирования эндотелиальных клеток (ЭК), центральным каналом с гидрогелем и жидкостным каналом.
- Покрытие каналов фибронектином и посев эндотелиальных клеток для формирования сплошного слоя эндотелия.
- Сборка автоматизированной системы микрофлюидного контроля, включающей шприцевые и перистальтические насосы, ловушку для пузырьков и программируемый контроль потока.
- Приложение контролируемого люминального напряжения сдвига, физиологического трансэндотелиального потока и градиентов VEGF.
- Оценка барьерной функции сосудов с помощью анализа проницаемости для FITC-декстрана.
- Количественная оценка спрутинга эндотелия при различных условиях напряжения сдвига.
Основные результаты
- В модели успешно сформированы перфузируемые эндотелизированые микроканалы, имитирующие раннюю неоваскуляризацию.
- Барьерная функция была подтверждена низкими коэффициентами проницаемости в каналах, выстланных клетками, по сравнению с пустыми каналами.
- Спутингование эндотелия в гидрогель наблюдалось после 24 часов статического культивирования.
- Увеличение напряжения сдвига в просвете значительно снижало степень и длину прорастания эндотелия.
- Система позволила динамически модулировать напряжение сдвига при сохранении физиологического трансэндотелиального потока.
Выводы
- Модель MIEN эффективно воспроизводит начальную микросреду неоваскуляризации in vitro.
- Сдвиговое напряжение является ключевым регулятором sprouting-образования эндотелия в данном контексте.
- Эта платформа перспективна для изучения механизмов неоваскуляризации, а также в качестве недорогого инструмента для скрининга лекарственных средств и токсикологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Моделирование неоваскуляризации на ранних стадиях имеет решающее значение для снижения рисков при проверке гипотез о сосудистых мишенях и повышения прогностической достоверности в процессах разработки лекарственных препаратов. Микрофлюидная платформа MIEN позволяет точно имитировать начальную микросреду сосудов, что способствует механистическому анализу и количественной оценке эндотелиальных ответов. Данная возможность улучшает трансляционную преемственность и позволяет оптимизировать отбор препаратов в портфеле терапевтических средств, нацеленных на сосудистую систему.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет снизить риски при изучении механизмов воздействия на сосудистые мишени за счет воспроизведения физиологического напряжения сдвига и градиентов VEGF.
- Обеспечивает функциональную валидацию поведения эндотелиальных клеток в контролируемых микросредовых условиях.
- Повышает прогностическую достоверность гипотез в области биологии сосудов на ранних этапах исследования.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую платформу для 3D-анализа с целью оценки влияния соединений на прорастание эндотелия.
- Позволяет получать количественные показатели, такие как коэффициенты проницаемости и метрики прорастания, для проведения надежного сравнения.
- Обеспечивает возможность масштабируемого скрининга кандидатов в препараты и токсикологических профилей в физиологически релевантном контексте.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты исследований in vitro с соответствующими механизмами сосудистых заболеваний для совершенствования стратегий трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации путем моделирования ранних событий неоваскуляризации.
- Снижает биологическую неопределенность при принятии решений о доклиническом продвижении программ, нацеленных на сосудистую систему.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Модель MIEN интегрируется в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, позволяя проводить проверку гипотез, количественный скрининг и механистическую валидацию сосудистых мишеней.
- Открывающая биология: способствует уточнению путей передачи сигналов и снижению биологических рисков за счет контролируемого манипулирования микроокружением.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для оценки соединений и стандартизации анализа.
- Аналитика: предоставляет данные о проницаемости и прорастании сосудов для сравнения экспериментальных условий и принятия обоснованных решений.
- Трансляционные исследования: связывает полученные in vitro данные о механизмах с доклиническими моделями сосудов при условии их соответствия патологии заболевания.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как многоразовая платформа для различных применений в области биологии сосудов и скрининга лекарственных препаратов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при валидации сосудистых мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует эндотелиальные тесты и обеспечивает воспроизводимость результатов между группами НИОКР.
- Стратегическая ценность: Служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет снижения рисков на ранних стадиях сосудистых программ.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию и продвижение активов, направленных на сосудистые мишени, с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области микрофлюидики, культивирования эндотелиальных клеток и количественного анализа анализов.
- Необходим доступ к программируемым насосам, микрофлюидным чипам и инфраструктуре для визуализации.
- Требуется межкомандная стандартизация настройки анализа и интерпретации данных.
- Может потребоваться адаптация для различных источников эндотелиальных клеток или моделей заболеваний.
- Ограничения включают низкую пропускную способность и необходимость специального технического обучения.
![Разработка и определение характеристик In Vitro Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са 2+] я И оксид азота Производство](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
